炎癥相關(guān)刺激對(duì)乳腺癌細(xì)胞MCF-7遷移能力的影響及其分子機(jī)制的初步研究.pdf

1、惡性腫瘤是人類死亡的第二大主要因素，而且有逐漸上升的趨勢(shì)，在有些發(fā)達(dá)國(guó)家，惡性腫瘤甚至以成為危害人類生命安全的頭號(hào)殺手。 而其中，乳腺癌是婦女最常見的惡性腫瘤之一，發(fā)病率位于女性惡性腫瘤之首。腫瘤生長(zhǎng)的微環(huán)境是促進(jìn)腫瘤進(jìn)展和活化休眠的癌細(xì)胞的潛在致癌因素。許多實(shí)體腫瘤中都可以發(fā)現(xiàn)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，如腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞（TILs）和巨噬細(xì)胞。這些炎癥細(xì)胞在腫瘤的發(fā)展中具有重要的作用：細(xì)胞轉(zhuǎn)化、血管生成、轉(zhuǎn)移。的確，在人乳腺癌和結(jié)直腸癌中

2、的巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)與腫瘤的血管生長(zhǎng)之間有著密切聯(lián)系，然而，腫瘤細(xì)胞原位產(chǎn)生的細(xì)胞因子發(fā)揮功能的重要性還不清楚。許多腫瘤的另一種特性是腫瘤細(xì)胞的低氧狀態(tài)和活性氧產(chǎn)物的生成。 前人的研究表明，TNF-α，活化的NFκB 和ROS 均可以在某些細(xì)胞引起EMT，但該效應(yīng)在乳腺癌細(xì)胞尚未見報(bào)道，而且TNF-α和ROS導(dǎo)致EMT 的機(jī)制也不清楚。而TNF-α可以活化NFκB 以及產(chǎn)生ROS，因此我們認(rèn)為很有必要研究活化的NFκB 和ROS 如何

3、導(dǎo)致EMT 以及各自在TNF-α誘導(dǎo)EMT 中的作用。 在發(fā)生EMT 的過程中，特定區(qū)域的上皮細(xì)胞基因表達(dá)發(fā)生徹底改變，其中E－鈣粘蛋白（E-cadherin）的下調(diào)似乎是關(guān)鍵事件。發(fā)生EMT 的細(xì)胞失去細(xì)胞極性和細(xì)胞間連接，細(xì)胞外基質(zhì)成分發(fā)生降解，細(xì)胞變得具有遷移性，可以從上皮上游離下來并遷移到不同的部位。 EMT 可由Snail 從不同途徑得到啟動(dòng)。Snail 在這個(gè)過程中發(fā)揮核心作用，協(xié)調(diào)不同的信號(hào)途徑。

4、 因此，本實(shí)驗(yàn)首先觀察了TNF-α對(duì)乳腺癌細(xì)胞系MCF-7 遷移能力的影響，在此基礎(chǔ)上觀察了TNF-α和ROS 對(duì)重要的轉(zhuǎn)錄因子Snail以及其下游分子E-cadherin 的表達(dá)的影響，探討了其中的可能機(jī)制。 盡管MCF-7 細(xì)胞的侵襲能力較低，我們發(fā)現(xiàn)經(jīng)過TNFα處理后其侵襲能力增強(qiáng)，遷移的細(xì)胞數(shù)目達(dá)到對(duì)照組的兩倍。與此一致，細(xì)胞表達(dá)的E-cadherin 水平下降，而Vimentin 水平升高。在此過程中Snail的

5、表達(dá)增加。 此外，我們的實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)NFκB的抑制劑阿司匹林可以阻止TNFα誘導(dǎo)EMT的發(fā)生，這表明在TNFα引發(fā)腫瘤轉(zhuǎn)移的過程中，NFκB扮演著重要作用。NFκB的抑制劑阿司匹林和mIκBα可以抑制Snail的表達(dá)增加以及Snail啟動(dòng)子的活性。相反，我們的實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)活性氧在TNFα促進(jìn)細(xì)胞轉(zhuǎn)移時(shí)扮演著次要作用，因?yàn)閱渭兦宄齌NFα產(chǎn)生的ROS并不明顯抑制EMT的發(fā)生。但是，我們的實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)H2O2自身可以促進(jìn)EMT，其作用通路與T

6、NFα誘導(dǎo)的EMT不同，其中NFκB僅發(fā)揮了次要的作用。 簡(jiǎn)言之，我們的實(shí)驗(yàn)涉及了TNFα在刺激細(xì)胞發(fā)生EMT時(shí)所起的重要作用，其中NFκB的作用主要是通過轉(zhuǎn)錄上調(diào)Snail和E-鈣粘蛋白的表達(dá)，而在活性氧引起的EMT中，NFκB的作用不十分重要，這為腫瘤轉(zhuǎn)移的預(yù)防過程中在不同的情況作用之下選擇不同的藥物提供了依據(jù)。事實(shí)也是如此，實(shí)驗(yàn)中我們發(fā)現(xiàn)Aspirin和NAC可以明顯降低TNFα和H2O2處理后遷移的細(xì)胞數(shù)，即可分別有效的

7、抑制TNFα和H2O2誘發(fā)的EMT。 基于前面的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，我們可以發(fā)現(xiàn)ROS 可以誘導(dǎo)Snail 的表達(dá)，促進(jìn)EMT 的發(fā)生。而ROS 的形成貫穿于很多生理病理過程。如表皮生長(zhǎng)因子（EGF），成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（FGF），轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β(TGFβ)，肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子（HGF），這些生長(zhǎng)信號(hào)刺激下均有ROS 的產(chǎn)生。這些信號(hào)分子已經(jīng)證實(shí)可以在不同的細(xì)胞背景下誘導(dǎo)Snail 基因。所有這些提示ROS 參與了多種信號(hào)條件下的EMT 的發(fā)

8、生。但是，前面的實(shí)驗(yàn)提示ROS 下游分子NFκB 在過程中并不扮演決定性作用。這使我們聯(lián)想到轉(zhuǎn)錄后水平的調(diào)控。 除了轉(zhuǎn)錄水平之外，轉(zhuǎn)錄后調(diào)控，如mRNA轉(zhuǎn)運(yùn)和翻譯，在基因的表達(dá)中也有重要的作用。盡管決定mRNA轉(zhuǎn)運(yùn)的機(jī)制仍然不清楚，但大家普遍認(rèn)為可能涉及到RNA結(jié)合蛋白識(shí)別特殊的RNA序列。近來大家較為關(guān)注一種調(diào)節(jié)mRNA穩(wěn)定性，由富含AU元件（AREs）介導(dǎo)的特殊途徑，這一般發(fā)生于生存期短的mRNAs的3 端非翻譯區(qū)。HuR

9、蛋白可以結(jié)合攜帶AREs的靶mRNA通過其RNA可識(shí)別區(qū)，從而調(diào)節(jié)許多靶mRNA的表達(dá)，包括編碼c-fos, 血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子，腫瘤壞死因子α,β-連環(huán)蛋白（?-catenin）,c-myc, 還氧化酶2（cyclooxygenase 2），肌細(xì)胞生成素（myogenin），MyoD，多種細(xì)胞周期調(diào)節(jié)蛋白，粒-巨噬細(xì)胞集落刺激因子，多種白細(xì)胞介素，p21, p27, p53 和熱休克蛋白70。 有趣的是，H2O2能夠增強(qiáng)HuR

10、的細(xì)胞漿定位，進(jìn)而增強(qiáng)HuR的功能。 對(duì)Snail的mRNA的結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，我們發(fā)現(xiàn)Snail分子含有多個(gè)HuR結(jié)合元件ARE，這促使我們聯(lián)想到H2O2可能通過增強(qiáng)HuR的細(xì)胞漿定位。 首先，我們用合成的HuR的siRNA和對(duì)照siRNA對(duì)MCF-7細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染，在轉(zhuǎn)染后36小時(shí)用Western blotting檢測(cè)轉(zhuǎn)染效率，發(fā)現(xiàn)70％的內(nèi)源性HuR被敲除。合成的HuR的siRNA和對(duì)照siRNA轉(zhuǎn)然后36小時(shí)的細(xì)胞加入

11、50μM H2O2 ，12小時(shí)后提取RNA。在si-HuR組可見Snail mRNA的減少，表明HuR在這個(gè)過程中發(fā)揮了作用，蛋白水平也發(fā)生同樣的變化。接著我們觀察了在HuR敲除細(xì)胞和對(duì)照組細(xì)胞中Snail的半衰期。 在加入H2O2 12小時(shí)后加入放線菌素D阻斷轉(zhuǎn)錄，在si-HuR可出現(xiàn)Snail半衰期的縮短，這說明了HuR可以增加Snail的穩(wěn)定性。 由于HuR一般是通過靶基因的位于3`端非翻譯區(qū)的ARE元件實(shí)現(xiàn)其

12、功能的，我們考慮是否HuR參與了通過假設(shè)的AREs調(diào)節(jié)Snail的3`端非翻譯區(qū)。因此我們將包括AREs的3’UTR和不含AREs的片斷分別克隆至pGL3-control載體,命名為pGL3-control-Snail 和pGL3-control-△Snail并轉(zhuǎn)染至si-HuR MCF-7細(xì)胞和對(duì)照細(xì)胞。在沒有經(jīng)過H2O2處理和HuR敲除的MCF-7細(xì)胞，相比于pGL3-control-△Snail，pGL3-control-Snai

13、l的活性較差，這說明了AREs作為一個(gè)元件發(fā)揮了穩(wěn)定性。另外，在HuR沒有敲除的MCF-7細(xì)胞，只有含有AREs的結(jié)構(gòu)對(duì)H2O2處理有反應(yīng)（H2O2處理后大約有2倍的變化），而在si-HuR MCF-7細(xì)胞中，包含AREs的結(jié)構(gòu)也很少對(duì)H2O2發(fā)生反應(yīng)。這些結(jié)果都顯示H2O2通過ARE 和HuR的相互作用增加Snail 的表達(dá)。 HuR主要位于細(xì)胞核中，在應(yīng)激條件下可以作為mRNA穩(wěn)定劑或翻譯調(diào)節(jié)因子進(jìn)入細(xì)胞漿中。為了評(píng)估H2

14、O2處理后引起相應(yīng)的HuR分布的變化，我們用經(jīng)過H2O2處理和未經(jīng)過處理的細(xì)胞用western blot方法研究亞細(xì)胞分布。結(jié)果顯示HuR主要位于細(xì)胞核中，經(jīng)過H2O2處理后6 小時(shí)，HuR在細(xì)胞質(zhì)中含量增多，但細(xì)胞內(nèi)總的HuR含量沒有明顯變化。這些結(jié)果顯示，H2O2增加Snail的表達(dá)至少部分的通過使HuR富集于細(xì)胞漿中而參與轉(zhuǎn)錄后調(diào)控實(shí)現(xiàn)的。但是，我們的實(shí)驗(yàn)并不否認(rèn)轉(zhuǎn)錄調(diào)控的重要性。事實(shí)上，Snail極少表達(dá)于沒有H2O2作用的MC

15、F-7 細(xì)胞中，因此，我們認(rèn)為經(jīng)過H2O2作用的MCF-7 細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄調(diào)控和轉(zhuǎn)錄后調(diào)控在下調(diào)Snail 中都具有重要作用。 最后，我們觀察了敲除HuR對(duì)H2O2誘導(dǎo)的細(xì)胞轉(zhuǎn)移的影響。我們觀察進(jìn)行和沒有進(jìn)行HuR敲除的MCF-7 細(xì)胞在H2O2作用下mRNA水平和蛋白水平上皮細(xì)胞鈣粘蛋白的表達(dá)。在沒有進(jìn)行HuR敲除組，H2O2處理后MCF-7 細(xì)胞上皮細(xì)胞鈣粘蛋白的轉(zhuǎn)錄減少（約4 倍）。在經(jīng)過HuR敲除地MCF-7 細(xì)胞中，這種

16、抑制過程僅部分地而不是全部地被消除（經(jīng)H2O2處理后大約2 倍下調(diào)），這表明HuR在誘導(dǎo)Snail和后續(xù)的抑制上皮細(xì)胞鈣粘蛋白過程中僅是部分地發(fā)揮作用。而且，單獨(dú)的HuR敲除似乎對(duì)于上皮細(xì)胞鈣粘蛋白的表達(dá)沒有作用。和mRNA情況相同，上皮細(xì)胞鈣粘蛋白的蛋白水平表現(xiàn)出了同樣的變化。我們還發(fā)現(xiàn)H2O2處理后si-HuR細(xì)胞的轉(zhuǎn)移能力明顯下降。因此，除了抗細(xì)胞凋亡能力之外，HuR可能還在細(xì)胞轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮重要作用。 總之，我們的研究