利拉魯肽對(duì)人乳腺癌MCF-7細(xì)胞增殖、凋亡的影響及其機(jī)制研究.pdf

1、目的:近來人們發(fā)現(xiàn)糖尿病與部分腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。在女性2型糖尿病患者中，乳腺癌發(fā)病率顯著高于非糖尿病患者。已有文獻(xiàn)報(bào)道，二甲雙胍可通過激活A(yù)MPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路改善乳腺癌患者的預(yù)后。利拉魯肽是GLP-1的類似物，已廣泛應(yīng)用于糖尿病患者的降糖治療。利拉魯肽可通過激活A(yù)MPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路發(fā)揮降糖以外生物學(xué)作用。那么，利拉魯肽是否亦可通過激活A(yù)MPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路影響乳腺癌細(xì)胞的增殖、凋亡尚不清楚。miR-27a有原癌基因活性，在乳腺癌，胃

2、癌，結(jié)腸癌，子宮內(nèi)膜癌等多種腫瘤細(xì)胞中呈高表達(dá)，具有調(diào)控乳腺癌細(xì)胞凋亡及細(xì)胞周期等功能。Targetscan網(wǎng)站預(yù)測(cè)AMPKa2可能是miR-27a的靶基因。AMPKa2表達(dá)在乳腺癌細(xì)胞MCF-7中廣泛受到抑制，具有腫瘤抑制因子的作用。綜上所述，利拉魯肽是否可以通過影響miR-27a表達(dá)，進(jìn)而上調(diào)AMPKa2表達(dá)，發(fā)揮抗腫瘤作用目前并不清楚。
　　因此在研究中，以 MCF-7（人乳腺癌）細(xì)胞為研究對(duì)象，探討利拉魯肽對(duì)乳腺癌細(xì)胞增殖

3、、凋亡的影響，并從miRNA層面探索其可能機(jī)制。
　　方法:
　　1.不同濃度利拉魯肽（10nM、100nM、1000nM、10000nM）干預(yù)MCF-7細(xì)胞48h，應(yīng)用CCK-8方法檢測(cè)MCF-7細(xì)胞增殖抑制率。
　　2.給予MCF-7細(xì)胞1000nM利拉魯肽干預(yù)24h、48h、72h，應(yīng)用CCK-8方法檢測(cè)MCF-7細(xì)胞增殖抑制率。
　　3.給予MCF-7細(xì)胞1000nM利拉魯肽干預(yù)48h，應(yīng)用平板克隆形成實(shí)

4、驗(yàn)檢測(cè)人乳腺癌MCF-7細(xì)胞克隆形成率；應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)MCF-7細(xì)胞早期和晚期凋亡率。
　　4.不同濃度利拉魯肽（10nM、100nM、1000nM）干預(yù)MCF-7細(xì)胞48h，應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法檢測(cè)MCF-7細(xì)胞miR-27a及AMPKα2 mRNA表達(dá)水平；應(yīng)用Western Blotting方法檢測(cè)AMPKα2蛋白表達(dá)水平。
　　5.miR-27a mimics和inhibitor轉(zhuǎn)染MCF-7細(xì)胞48h，應(yīng)

5、用實(shí)時(shí)熒光定量PCR和Western Blotting方法檢測(cè)MCF-7細(xì)胞AMPKα2表達(dá)水平。
　　6.雙熒光素報(bào)告酶基因分析實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證miR-27a可結(jié)合AMPKα23’-UTR。
　　7.miR-27a mimics和inhibitor轉(zhuǎn)染MCF-7細(xì)胞48h，應(yīng)用CCK-8方法檢測(cè)MCF-7細(xì)胞光密度值，并計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率；應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)MCF-7細(xì)胞早期和晚期凋亡率；應(yīng)用Western Blotting方法檢

6、測(cè)PCNA、caspase-3蛋白表達(dá)水平。
　　結(jié)果：
　　1.不同濃度利拉魯肽（10nM、100nM、1000nM、10000nM）干預(yù)MCF-7細(xì)胞48h，MCF-7細(xì)胞增殖抑制率分別為10.3％，37.34%，58.8%，以及89.27%，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　2.給予MCF-7細(xì)胞1000nM利拉魯肽干預(yù)24h、48h、72h，MCF-7細(xì)胞增殖抑制率分別為13.11%，45.3%以及53.59%，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)

7、差異。
　　3.給予MCF-7細(xì)胞1000nM利拉魯肽干預(yù)48h，MCF-7細(xì)胞克隆形成率為對(duì)照組的69.37%；早期、晚期凋亡率分別為1.26%±0.18%、6.06%±0.32%，與空載體組（0.81%±0.13%、4.27%±0.26%）比較，兩組晚期凋亡率存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　4.不同濃度利拉魯肽（10nM、100nM、1000nM）干預(yù) MCF-7細(xì)胞48h， miR-27a表達(dá)較對(duì)照組分別降低15.5%、44.5

8、%、61.8%；AMPKα2 mRNA表達(dá)較對(duì)照組分別增加1.61倍、6.63倍和9.25倍；AMPKα2蛋白表達(dá)分別增加1.5倍、4.0倍和6.8倍，差別具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　5.雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)顯示，AMPKα2野生型3'UTR基因報(bào)告質(zhì)粒與miR-27a共轉(zhuǎn)染后，熒光素酶活性明顯降低。
　　6.miR-27a mimics轉(zhuǎn)染MCF-7細(xì)胞48h，miR-27a表達(dá)量約為陰性對(duì)照組3.33倍；AMPKα2 mRN

9、A、蛋白表達(dá)分別下調(diào)57.77%、52.55%；miR-27a inhibitor轉(zhuǎn)染MCF-7細(xì)胞48h，miR-27a表達(dá)量為陰性對(duì)照組的43.19%；AMPKα2 mRNA、蛋白表達(dá)分別增加1.61倍、2.27倍。
　　7.miR-27a mimics轉(zhuǎn)染MCF-7細(xì)胞48h，兩組早期、晚期凋亡率分別為0.79%±0.09%、2.16%±0.41%，與空載體組（0.88%±0.11%、4.71%±0.23%）比較，晚期凋亡百

10、分比差別具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；PCNA蛋白表達(dá)增加2倍、caspase-3蛋白表達(dá)降低28.56%。miR-27a inhibitor轉(zhuǎn)染MCF-7細(xì)胞48h， miR-27a inhibitor組的增殖抑制率為56.78%±2.24%。兩組早期、晚期凋亡率分別為1.31%±0.07%、6.91%±0.27%，與空載體組（0.88%±0.11%、4.71%±0.23%）比較，兩組晚期凋亡百分比差別具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義； PCNA蛋白表達(dá)減低43.2