雙氫青蒿素通過抑制破骨細胞與乳腺癌細胞防治乳腺癌骨轉(zhuǎn)移破壞.pdf

1、目的:
　　研究雙氫青蒿素對破骨細胞分化的影響，以及明確雙氫青蒿素在防治乳腺癌骨轉(zhuǎn)移導致的骨破壞中的作用。
　　方法:
　　1、破骨細胞分化誘導實驗:C57BL6小鼠獲得骨髓來源的巨噬細胞(BMMs)，在含不同雙氫青蒿素濃度的破骨細胞誘導培養(yǎng)基中培養(yǎng)至破骨細胞形成，TRAP染色，顯微鏡下計數(shù)破骨細胞并拍照;并通過CCK-8法檢測排除雙氫青蒿素對BMMs的毒性作用。
　　2、體外骨吸收實驗:將骨片逐個移至96孔板中

2、，BMMs以2.4×10*4/cm2的密度種于骨片之上，在含不同雙氫青蒿素濃度的破骨細胞誘導培養(yǎng)基中培養(yǎng)至破骨細胞形成后（control孔可觀察），繼續(xù)培養(yǎng)48h，以利于破骨細胞充分完成骨吸收過程，取出骨片后，刷凈骨片表面細胞、噴金、掃描電鏡分析骨片表面骨陷窩形成。
　　3、破骨相關(guān)信號通路研究:RAW264.7細胞種板，加6.25μM雙氫青蒿素培養(yǎng)4h;50ng/mL RANKL刺激RAW264.7細胞0min，10min，30

3、min，迅速吸棄上清，提取總蛋白，用來做MAPK、IκBα、AKT信號通路;破骨細胞誘導分化過程中，提取第0天、第1天、第3天及第5天對照與藥物的細胞總蛋白用來做SRC信號通路;Western印跡法檢測蛋白表達變化。
　　4、鈦顆粒介導的C57小鼠顱蓋骨骨吸收動物模型實驗:8周齡C57小鼠24只，隨機分為4組，空白對照組、陽性對照組、低濃度藥物組和高濃度藥物組，每組6只;造模組麻醉成功后，在無菌條件下切開顱蓋骨骨膜，取30mg鈦顆

4、粒均勻放入顱蓋骨表面，縫合皮膚;給予或不給藥物處理喂養(yǎng)10天，麻醉后全部引頸處死，解剖取顱蓋骨，行micro-CT檢測;脫鈣、石蠟包埋、病理切片，行TRAP染色分析破骨細胞在不同組之間的變化。
　　5、乳腺癌細胞增殖、遷移及凋亡實驗:選取增殖期MDA-MB-231細胞，待細胞長至90％孔底后，實驗組加入含不同藥物濃度的無血清培養(yǎng)基，空白對照組只加無血清培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后收集細胞，流式細胞儀檢測雙氫青蒿素對MDA-MB-23

5、1細胞的凋亡作用;劃痕實驗檢測雙氫青蒿素對MDA-MB-231細胞的遷移作用;并通過CCK-8法檢測雙氫青蒿素對MDA-MB-231細胞的增殖抑制作用。
　　6、MDA-MB-231細胞介導的裸鼠骨轉(zhuǎn)移破壞動物模型研究:5-6周雌性BALB/c nu/nu小鼠18只，隨機分為3組，空白對照組、陽性對照組和藥物組，每組6只;造模組用微量注射器刺破造模組裸鼠右下肢脛骨平臺，將處于生長對數(shù)期MDA-MB-231細胞注入骨髓腔;陽性對照組

6、給予無菌PBS腹腔注射，藥物組給予100μg/kg/天的雙氫青蒿素腹腔注射;喂養(yǎng)一個月，麻醉后全部引頸處死，剪掉右下肢，行micro-CT檢測。
　　結(jié)果:
　　1.破骨細胞分化實驗中，在雙氫青蒿素濃度為1.56μ M時破骨細胞數(shù)量明顯減少，3.125μ M時破骨細胞形成顯著受到抑制，6.25μ M時基本無明顯破骨細胞分化形成。統(tǒng)計結(jié)果顯示在Control組破骨細胞數(shù)量每孔平均為272.00±12.77個，在雙氫青蒿素濃度為

7、1.56μM時破骨細胞數(shù)量每孔平均為172±11.79個，雙氫青蒿素濃度為3.125μ M時破骨細胞數(shù)量每孔平均為60±2.11個，雙氫青蒿素濃度為6.25μ M時破骨細胞數(shù)量每孔平均為11±1.78個。48h CCK-8結(jié)果顯示雙氫青蒿素是在對BMMs無毒性影響下發(fā)揮抑制破骨細胞分化作用的。（*p＜0.05，**p＜0.01）
　　2、在體外骨片骨吸收實驗中，在Control組有大量的破骨細胞骨吸收造成的骨陷窩形成，而在雙氫青蒿

8、素處理組，骨陷窩所占骨片面積逐漸減小，差異均有統(tǒng)計學意義。（*p＜0.05，**p＜0.01）
　　3、在RANKL刺激10min/30min時，MAPK磷酸化的蛋白表達與雙氫青蒿素濃度無關(guān)系;IκBα蛋白的表達可以反映NF-κ B信號通路的變化，在RANKL刺10min/30min時，IκBα蛋白的表達均發(fā)生了下降，并且Control組與雙氫青蒿素濃度組無明顯差異;RANKL刺激30min時，雙氫青蒿素濃度明顯抑制了p-AKT的

9、表達;另外，雙氫青蒿素可顯著抑制SRC的表達，因此，雙氫青蒿素可能是通過AKT/SRC信號通路抑制破骨細胞分化成熟。
　　4、C57小鼠顱蓋骨micro-CT檢測顯示，在陽性對照組，鈦顆粒顯著引起了顱蓋骨骨丟失，而在藥物組雙氫青蒿素明顯抑制了鈦顆粒介導的骨丟失。組織切片TRAP染色結(jié)果顯示，在雙氫青蒿素處理組破骨細胞數(shù)目明顯減少，說明雙氫青蒿素在動物體內(nèi)可以有效抑制破骨細胞骨吸收。統(tǒng)計學結(jié)果顯示BV/TV在Sham組平均為0.81

10、±0.01，在Vehicle組平均為0.582±0.042，在雙氫青蒿素低濃度組平均為0.699±0.054，在雙氫青蒿素高濃度組平均為0.659±0.045。（*p＜0.05，**p＜0.01）
　　5、MDA-MB-231細胞經(jīng)雙氫青蒿素培養(yǎng)24小時后，流式凋亡結(jié)果說明雙氫青蒿素可以介導MDA-MB-231細胞的凋亡。MDA-MB-231細胞劃痕后，不同濃度雙氫青蒿素培養(yǎng)，12小時及24小時結(jié)果顯示雙氫青蒿素明顯抑制了MDA-

11、MB-231細胞遷移過程。48h CCK-8結(jié)果顯示雙氫青蒿素可顯著抑制MDA-MB-231細胞增殖。
　　6、在MDA-MB-231細胞骨轉(zhuǎn)移骨破壞的裸鼠實驗中發(fā)現(xiàn)，與陰性對照組相比，陽性對照組骨破壞及骨丟失明顯，而在藥物處理組，雙氫青蒿素組明顯抑制了骨破壞。BV/TV在陰性對照組平均值為0.389±0.034，在陽性對照組為0.111±0.009，在藥物處理組為0.205±0.022。（*p＜0.05，**p＜0.01）