RECK蛋白在異甘草素抑制乳腺癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移中的作用.pdf

1、乳腺癌已經(jīng)在世界范圍內(nèi)成為導(dǎo)致女性人群死亡的主要因素，而腫瘤細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移是乳腺癌致死的重要原因。腫瘤細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移過(guò)程由多個(gè)步驟構(gòu)成，其中基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteases，MMPs)降解細(xì)胞外基質(zhì)在腫瘤細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移的過(guò)程中發(fā)揮了重要作用。體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)證據(jù)表明RECK蛋白可以通過(guò)負(fù)向調(diào)控MMP2和MMP9的功能進(jìn)而抑制腫瘤細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移，而且在腫瘤進(jìn)展過(guò)程中，RECK蛋白表達(dá)減少甚至丟失，因此在腫瘤細(xì)胞中

2、恢復(fù)RECK蛋白的表達(dá)對(duì)于抑制腫瘤細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移至關(guān)重要。異甘草素是從中草藥甘草中提取的一種植物化學(xué)物，目前已發(fā)現(xiàn)其具有抗炎和抗氧化等功能，但目前關(guān)于其能否通過(guò)上調(diào)腫瘤抑制基因RECK的表達(dá)抑制腫瘤細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移尚未有報(bào)道。
　　目的:
　　本研究以人三陰乳腺癌細(xì)胞系Hs-578T和MDA-MB-23I為研究對(duì)象，探討異甘草素抑制乳腺癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移的機(jī)制及RECK蛋白在其中的作用，從而為腫瘤的膳食干預(yù)提供更多的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

3、r>　　方法:
　　采用MTT實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞活力;采用預(yù)先鋪好matrigel的Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)乳腺癌細(xì)胞的侵襲能力;采用明膠酶譜實(shí)驗(yàn)檢測(cè)MMP2和MMP9的活性;采用RT-PCR和實(shí)時(shí)定量PCR實(shí)驗(yàn)檢測(cè)基因的mRNA水平;采用實(shí)時(shí)定量PCR實(shí)驗(yàn)檢測(cè)miR-21的表達(dá)水平;采用蛋白質(zhì)印跡實(shí)驗(yàn)檢測(cè)基因的蛋白水平;采用染色質(zhì)免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)檢測(cè)stat3在miR-21啟動(dòng)子區(qū)域的結(jié)合豐度;采用細(xì)胞瞬時(shí)轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)敲除RECK和PIA

4、S3、高表達(dá)或低表達(dá)miR-21。
　　結(jié)果:
　　(1)異甘草素能夠抑制乳腺癌MDA-MB-231和Hs-578T細(xì)胞的侵襲能力:首先，采用MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)20.0和10.0μM分別是異甘草素處理乳腺癌細(xì)胞24和48小時(shí)不影響細(xì)胞活力的最高濃度;采用Transwell實(shí)驗(yàn)證實(shí)異甘草素能夠在不影響細(xì)胞活力的前提下，下調(diào)乳腺癌細(xì)胞的侵襲能力;采用RT-PCR實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)異甘草素可以呈劑量依賴性和時(shí)間依賴性地下調(diào)乳腺癌細(xì)胞內(nèi)MMP

5、9的mRNA，但MMP2的mRNA并未受影響;采用明膠酶譜實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)異甘草素可以下調(diào)MMP9的活性，同樣，MMP2的活性未受影響。
　　(2)異甘草素通過(guò)上調(diào)RECK的蛋白水平抑制MMP9:機(jī)制研究證據(jù)指出乳腺癌細(xì)胞經(jīng)過(guò)異甘草素處理后RECK的蛋白水平上調(diào)，其mRNA水平未發(fā)生改變，而當(dāng)使用RECK siRNA干擾異甘草素誘導(dǎo)的RECK蛋白高表達(dá)后，異甘草素對(duì)細(xì)胞內(nèi)MMP9表達(dá)、活性及細(xì)胞侵襲能力的抑制作用被逆轉(zhuǎn)。
　　(3)

6、異甘草素通過(guò)抑制miR-21上調(diào)RECK的蛋白表達(dá):實(shí)時(shí)定量PCR實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)異甘草素可以呈劑量依賴性和時(shí)間依賴性地下調(diào)兩株乳腺癌細(xì)胞中miR-21的表達(dá)，并且當(dāng)使用特異性抑制劑干擾細(xì)胞內(nèi)miR-21的表達(dá)后，RECK的蛋白水平上調(diào)，mRNA未受影響。當(dāng)在異甘草素處理的細(xì)胞中重新高表達(dá)miR-21后，異甘草素對(duì)RECK的誘導(dǎo)作用被抵消，并且細(xì)胞的侵襲能力也有一定的恢復(fù)。
　　(4)異甘草素下調(diào)stat3在miR-21啟動(dòng)子區(qū)域的結(jié)合豐

7、度:染色質(zhì)免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)及蛋白質(zhì)印跡實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)異甘草素在磷酸化后水平降低轉(zhuǎn)錄因子stat3在miR-21啟動(dòng)子區(qū)域的結(jié)合豐度。
　　(5)異甘草素通過(guò)上調(diào)PIAS3表達(dá)影響stat3在miR-21啟動(dòng)子區(qū)域的結(jié)合豐度:蛋白質(zhì)印跡實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)stat3的特異性抑制分子PIAS3在經(jīng)過(guò)異甘草素處理的乳腺癌細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)，當(dāng)使用PIAS3 siRNA干擾異甘草素誘導(dǎo)的PIAS3高表達(dá)后，stat3在miR-21啟動(dòng)子區(qū)域結(jié)合豐度及miR-