金雀異黃素通過(guò)調(diào)節(jié)miR-34a抑制乳腺癌細(xì)胞的增殖和侵襲.pdf

1、乳腺癌是女性最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，具有高發(fā)病率及死亡率，容易復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移。近年來(lái)，在治療乳腺癌方面已經(jīng)取得了巨大的成就，但仍不足以克服腫瘤細(xì)胞的逃跑和抵抗機(jī)制，我們需要進(jìn)一步研究腫瘤發(fā)生發(fā)展的機(jī)制并發(fā)現(xiàn)更多高療效、低毒性的抗腫瘤藥物。
　　金雀異黃素是在豆制品中提取的一種大豆異黃酮。近年來(lái)的研究表明它具有抗癌特性，可用來(lái)治療各類型的癌癥，并且對(duì)正常細(xì)胞毒性低。金雀異黃素還可通過(guò)調(diào)節(jié)microRNA及其靶基因的表達(dá)來(lái)影響腫瘤的形成和發(fā)

2、展。然而，它在乳腺癌中如何通過(guò)調(diào)節(jié)microRNAs發(fā)揮抑癌作用尚未報(bào)道。
　　MicroRNA是一類長(zhǎng)度約為20-25個(gè)核苷酸的非編碼單鏈小分子RNA，主要是通過(guò)調(diào)控其靶基因的表達(dá)發(fā)揮作用，在人類腫瘤細(xì)胞中往往能發(fā)現(xiàn)miR-34a表達(dá)水平相對(duì)較低，而提高miR-34a的表達(dá)水平能促進(jìn)各類型腫瘤細(xì)胞凋亡、細(xì)胞周期阻滯及衰老，抑制其增殖、遷移和侵襲。
　　HMGA2是一種非組蛋白染色質(zhì)相關(guān)蛋白，主要功能是作為轉(zhuǎn)錄因子和癌胚蛋白

3、。HMGA2幾乎在所有惡性腫瘤中高表達(dá)，而在正常組織中未發(fā)現(xiàn)，并且在高級(jí)別和惡性程度較高的腫瘤中表達(dá)量較高，它與腫瘤的發(fā)生發(fā)展及不良預(yù)后息息相關(guān)。
　　目的:研究金雀異黃素對(duì)miR-34a的表達(dá)以及乳腺癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲能力的影響，為金雀異黃素應(yīng)用于臨床治療乳腺癌提供理論基礎(chǔ)和實(shí)踐依據(jù);
　　方法:以人乳腺癌MCF-7細(xì)胞為對(duì)象，采用qRT-PCR技術(shù)檢測(cè)金雀異黃素對(duì)MCF-7細(xì)胞中miR-34a表達(dá)的影響，利用CCK-

4、8實(shí)驗(yàn)檢測(cè)金雀異黃素作用48小時(shí)的半數(shù)抑制濃度，采用該濃度進(jìn)行下面的實(shí)驗(yàn)，將miR-34a模擬物轉(zhuǎn)染到MCF-7細(xì)胞系中，然后采取CCK-8實(shí)驗(yàn)、克隆形成實(shí)驗(yàn)、劃痕實(shí)驗(yàn)及侵襲實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證金雀異黃素和miR-34a及其聯(lián)合作用對(duì)MCF-7細(xì)胞增殖、克隆形成、遷移和侵襲能力的影響，western blotting和qRT-PCR實(shí)驗(yàn)被用來(lái)研究金雀異黃素和miR-34a及其聯(lián)合作用以及miR-34a抑制物對(duì)HMGA2蛋白和mRNA水平的影響。轉(zhuǎn)染

5、siRNA-HMGA2至MCF-7細(xì)胞中，敲除HMGA2基因以探究HMGA2對(duì)乳腺癌細(xì)胞增殖和克隆形成能力的影響。
　　結(jié)果:1.金雀異黃素作用乳腺癌MCF-7細(xì)胞48小時(shí)的半數(shù)抑制濃度為8.05μM;2.金雀異黃素處理后，MCF-7細(xì)胞中miR-34a的表達(dá)量明顯上升;3.CCK-8結(jié)果顯示:金雀異黃素處理組活細(xì)胞比例為0.50±0.03，miR-34a處理組活細(xì)胞比例為0.46±0.01，金雀異黃素與miR-34a聯(lián)合處理組活

6、細(xì)胞比例為0.27±0.01，(P＜0.01)，金雀異黃素或miR-34a處理后，乳腺癌細(xì)胞的增殖能力受到了明顯抑制并且兩者聯(lián)合作用更加顯著;陰性對(duì)照組活細(xì)胞比例為0.91±0.02，siRNA-HMGA2組活細(xì)胞比例為0.37±0.02，敲除HMGA2能有效抑制乳腺癌細(xì)胞的增殖能力;4.克隆形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:4個(gè)組（空白對(duì)照組、金雀異黃素處理組、miR-34a處理組和聯(lián)合處理組）克隆集數(shù)量依次為204.67±9.07、104.33±1

7、1.93、95.33±10.11、54.67±8.33，(P＜0.01)，金雀異黃素或miR-34a處理后，乳腺癌細(xì)胞的克隆形成能力受到了明顯抑制并且兩者聯(lián)合作用更加顯著;空白對(duì)照、陰性對(duì)照和siRNA-HMGA2組克隆集數(shù)量依次為344±9.85、325.7±14.05、235±12.53，敲除HMGA2后乳腺癌細(xì)胞克隆形成能力明顯減弱;5.劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:上述4個(gè)組24小時(shí)細(xì)胞遷移率依次為50％、37.5％、27.8％、16.7％

8、，(P＜0.01)，金雀異黃素或miR-34a處理后，乳腺癌細(xì)胞的遷移能力受到了明顯抑制并且兩者聯(lián)合作用更加顯著;6.侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:上述4個(gè)組穿膜細(xì)胞數(shù)量依次為135.00±9.85、53.67±7.02、47.33±4.93、32.33±5.86，(P＜0.01)，金雀異黃素或miR-34a處理后，能夠抑制乳腺癌細(xì)胞的侵襲能力并且兩者聯(lián)合作用更加顯著;7.qRT-PCR和western blotting實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:與空白對(duì)照組相

9、比，金雀異黃素處理后或轉(zhuǎn)染miR-34a模擬物后， HMGA2 mRNA和蛋白表達(dá)均降低，并且兩者聯(lián)合作用更加顯著，而抑制miR-34能上調(diào)HMGA2的表達(dá);HMGA2 siRNA-1能有效的敲除HMGA2基因，抑制其蛋白的表達(dá)。
　　結(jié)論:金雀異黃素或miR-34a均能抑制人乳腺癌MCF-7細(xì)胞的增殖能力、克隆形成能力、遷移能力和侵襲能力，并且金雀異黃素可能是通過(guò)上調(diào)miR-34a來(lái)抑制乳腺癌細(xì)胞的生物學(xué)功能的。金雀異黃素或mi