BMP9通過調(diào)節(jié)乳腺癌細胞和前體脂肪細胞相互作用抑制乳腺癌的研究.pdf

1、目的：
　　將乳腺癌細胞MDA-MB-231與前體脂肪細胞3T3-L1共培養(yǎng)來模擬乳腺脂肪微環(huán)境,從體內(nèi)和體外兩個方面研究人類骨形態(tài)發(fā)生蛋白9對乳腺脂肪微環(huán)境中乳腺癌MDA-MB-231細胞增殖和遷移的影響及其可能的分子機制。
　　方法：
　　以惡性程度較高的乳腺癌MDA-MB-231細胞作為研究對象,將重組腺病毒AdBMP9 (以AdGFP作為對照)及干擾腺病毒AdsiBMP9(以AdRFP作為對照)感染MDA-MB

2、-231細胞,構建重組MDA-MB-231/AdBMP9過表達細胞株(MDA-MB-231/AdGFP為對照細胞)及重組MDA-MB-231/AdsiBMP9干擾細胞株(MDA-MB-231/AdRFP為對照細胞),分別與前體脂肪細胞3T3-L1在Transwell體系中間接共培養(yǎng)3 d。
　　實驗分組如下：
　　①MDA-MB-231細胞+3T3-L1細胞共培養(yǎng)作為空白組,以Co-Blank表示；
　?、贛DA-MB

3、-231/AdGFP細胞+3T3-L1細胞共培養(yǎng)作為過表達對照組,以Co-AdGFP表示；
　　③MDA-MB-231/AdRFP細胞+3T3-L1細胞共培養(yǎng)作為干擾對照組,以Co-AdRFP表示；
　?、躆DA-MB-231/AdBMP9細胞+3T3-L1細胞共培養(yǎng)作為過表達實驗組,以Co-AdBMP9表示；
　?、軲DA-MB-231/AdsiBMP9細胞+3T3-L1細胞共培養(yǎng)作為干擾實驗組,以Co-AdsiBM

4、P9表示。針對共培養(yǎng)體系中的MDA-MB-231細胞：RT-PCR及蛋白質(zhì)印跡技術檢測其BMP9的過表達及干擾情況；通過MTT實驗檢測其增殖能力；Transwell實驗和劃痕愈合實驗檢測其遷移能力的變化；流式細胞術(FCM)檢測其周期變化；免疫熒光檢測其瘦素受體(OB-R)的表達；蛋白質(zhì)印跡技術檢測其瘦素(leptin)、瘦素長受體(OB-Rb)及短受體(OB-Rt)和leptin信號通路關鍵分子的表達情況。蛋白質(zhì)印跡技術檢測共培養(yǎng)體系

5、中前體脂肪細胞3T3-L1的leptin表達水平;ELISA技術檢測培養(yǎng)液中的leptin分泌水平。將前體脂肪細胞分別與各重組乳腺癌細胞以2.5×107：5×106/鼠的比例混合后,通過皮下注入裸鼠的體內(nèi),進行皮下成瘤。每隔5天測定一次瘤體大小,21天后將裸鼠處死,留取瘤組織做HE染色觀察瘤體分化情況；免疫組織化學染色檢測瘤體中l(wèi)eptin、c-Myc、CyclinD1、MMP9、p-ERK1/2、p-STAT3的表達情況。
　　

6、結果：
　?、賀T-PCR及蛋白質(zhì)印跡結果顯示BMP9過表達的乳腺癌細胞株MDA-MB-231/AdBM9及BMP9低表達的干擾細胞株MDA-MB-231/AdsiBM9構建成功；
　?、谂c3T3-LI細胞共培養(yǎng)后,針對乳腺癌細胞的實驗結果發(fā)現(xiàn)：MTT結果顯示BMP9過表達組(Co-AdBMP9)的細胞增殖較對照組受到明顯抑制(P0.05),Co-AdsiBMP9組的細胞增殖活力較對照組明顯升高(P0.05)；流式細胞術(F

7、CM)檢測結果表明Co-AdBMP9組的細胞周期阻滯于G2/M期(P0.05)；劃痕愈合實驗發(fā)現(xiàn)48h后Co-AdBMP9組劃痕愈合率較對照組顯著降低(P0.05),而Co-AdsiBMP9組劃痕愈合率較對照組明顯升高(P0.05)；Transwell遷移實驗顯示24h后Co-AdBMP9組乳腺癌細胞穿膜數(shù)顯著低于對照組(P0.05),而Co-AdsiBMP9組腫瘤細胞穿膜數(shù)顯著高于對照組(P0.05)；免疫熒光結果顯示乳腺癌MDA-M

8、B-231細胞瘦素受體OB-R表達陽性。Western blotting結果表明leptin、OB-Rb、OB-Rt表達水平在Co-AdBMP9、Co-AdsiBMP9組與對照組相比無明顯變化(P0.05)；Western blotting檢測瘦素信號通路相關分子的表達情況,結果顯示Co-AdBMP9組p-ERK1/2、p-STAT3的表達明顯降低(P0.05),Co-AdsiBMP9組與對照組相比明顯升高(P0.05),但Co-AdB

9、MP9組和Co-AdsiBMP9組p-Akt的表達均無明顯變化(P0.05)：同時,Co-AdBMP9組leptin信號通路下游靶因子c-Myc、CyclinD1、MMP9、VEGF的表達明顯降低(P0.05),Co-AdsiBMP9組與對照組相比明顯升高(P0.05)。
　?、踂estern blotting結果顯示前體脂肪細胞3T3-L1的leptin表達水平在Co-AdBMP9組顯著下調(diào)(P0.05),而Co-AdsiBMP

10、9組leptin的表達水平與對照組相比明顯升高(P0.05)；ELISA結果發(fā)現(xiàn)Co-AdBMP9組的leptin分泌量與對照組相比明顯降低(P0.05),而Co-AdsiBMP9組與對照組相比明顯升高(P0.05)；
　?、軇游飳嶒灲Y果表明：Co-AdBMP9組的皮下瘤體積明顯比對照組小(P0.05),而Co-AdsiBMP9組瘤體明顯增大于對照組(P0.05)；HE染色結果顯示Co-AdBMP9組腫瘤細胞分化較對照組高,而Co

11、-AdsiBMP9組腫瘤細胞的分化程度比照組低；免疫組縱化學梁色表明Co-AdBMP9組leptin、c-Myc、CyclinD1、MMP9、p-ERK1/2和p-STAT3的染色強度明顯低于對照組,而Co-AdsiBMP9組的染色強度明顯比對照組高。結論在體內(nèi)外模擬乳腺脂肪微環(huán)境中,BMP9可以通過調(diào)節(jié)乳腺癌細胞和前體脂肪細胞的相互作用,從而抑制乳腺癌MDA-MB-231細胞的增殖和遷移。其可能的機制為：BMP9抑制前體脂肪細胞3T3