ING4通過逆轉上皮間充質轉化(EMT)抑制乳腺癌細胞的遷移和侵襲.pdf

1、目的：探討慢病毒介導的生長抑制因子ING4過表達對乳腺癌細胞遷移、侵襲的作用及其機制。
　　方法：
　?。?）以攜帶人源化ING4編碼序列（CDS）的pAdTrack-CMV/ING4質粒為模板，利用ING4特異性引物（ING4-F：5'-gaa gct agc gcc acc atg gct gct ggg atg tat ttg-3'；ING4-R：5'-ata ggc gcg ccc tat ttc ttc ttc c

2、gt tct tg-3'）
　　通過PCR擴增獲得ING4 CDS片段。
　?。?）在GFP標記的pLenti6.3/IRES/GFP慢病毒質粒的NheI和SgsI限制性酶切位點之間插入ING4目的片段構建ING4重組慢病毒質粒pLenti6.3/ING4/IRES/GFP，并通過PCR、雙酶切、DNA測序鑒定。
　?。?）用脂質體Lipofectamine2000將構建正確的pLenti6.3/ING4/IRES/G

3、FP及其對照pLenti6.3/IRES/GFP慢病毒質粒分別與輔助包裝質粒pLP1、pLP2、VSVG共轉染293T人胚腎細胞包裝GFP標記的ING4重組慢病毒（LV-ING4）及其對照空病毒（LV），并將慢病毒培養(yǎng)上清高速離心濃縮后，用有限稀釋法根據GFP的表達進行滴度測定。
　　（4）LV-ING4、LV分別用10MOI的最佳感染劑量感染MDA-MB-468三陰性乳腺癌細胞，通過10μg/ml的滅瘟素（BSD）篩選后獲得MD

4、A-MB-468-LV-ING4（簡寫為MDA-MB-468-ING4）、MDA-MB-468-LV（簡寫為MDA-MB-468-Mock）。熒光顯微鏡、流式細胞儀檢測GFP分析轉基因效率，及RT-PCR、Western blot檢測慢病毒介導ING4在MDA-MB-468細胞中的表達。
　　(5)采用Transwell遷移、侵襲實驗檢測MDA-MB-468-ING4、MDA-MB-468-Mock乳腺癌細胞的遷移、侵襲能力，分析

5、慢病毒介導的ING4過表達對MDA-MB-468三陰性乳腺癌細胞遷移、侵襲的作用。
　　(6)利用Western blot檢測MDA-MB-468-ING4、MDA-MB-468-Mock乳腺癌細胞上皮間充質轉化（EMT）相關蛋白（E-cadherin、N-cadherin、Snail1、Snail2、Zeb1、Zeb2、Twist1、Twist2）的表達，分析慢病毒介導的ING4過表達抑制MDA-MB-468三陰性乳腺癌細胞遷移

6、、侵襲的分子機制。
　　結果：
　?。?）成功制備了表達人源化ING4的GFP標記重組慢病毒（LV-ING4）。
　?。?）成功構建了慢病毒介導的ING4轉基因MDA-MB-468三陰性乳腺癌細胞。
　　（3）慢病毒介導的ING4過表達能夠明顯抑制MDA-MB-468三陰性乳腺癌細胞的遷移、侵襲能力，MDA-MB-468-ING4較MDA-MB-468-Mock的相對遷移、侵襲力分別為45.7％、36.8%。