CUL4A促進乳腺癌細胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化及侵襲轉(zhuǎn)移的作用機制研究.pdf

1、乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤之一，已位居婦女惡性腫瘤死因的首位。我國乳腺癌的發(fā)病率雖相對于西方歐美國家較低，但近年來隨著人們生活水平的提高和生活方式的改變，其發(fā)病率呈上升趨勢，全國平均乳腺癌死亡率已達2.61/10萬人次?，F(xiàn)階段乳腺癌治療主要采取手術為主的綜合治療，包括放療、化療和內(nèi)分泌治療等。經(jīng)大量隨訪發(fā)現(xiàn)，Ⅱ-Ⅲ期患者雖然經(jīng)手術治療或放化療，5年內(nèi)仍有60-70％患者出現(xiàn)復發(fā)轉(zhuǎn)移，而遠端轉(zhuǎn)移是乳腺癌患者死亡的主要原因之一。近期研究表

2、明，乳腺癌細胞的上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transitions，EMT)是其發(fā)生轉(zhuǎn)移的主要原因，EMT是指具有極性的細胞獲得自由移動于細胞基質(zhì)間的能力的過程，以上皮表型缺失和間質(zhì)表型獲得為主要特征。乳腺癌細胞通過EMT獲得更強的移動和侵襲能力，穿過細胞外基質(zhì)及血管基底膜進入循環(huán)系統(tǒng)，進而形成遠處繼發(fā)性轉(zhuǎn)移灶，是乳腺癌轉(zhuǎn)移的關鍵步驟。因此，尋找參與調(diào)節(jié)乳腺癌細胞EMT的分子標記物能夠作為乳腺癌預后的指

3、標，而且以此為靶點，在深入研究其調(diào)節(jié)乳腺癌細胞侵襲轉(zhuǎn)移的分子機制基礎上，研發(fā)相應的個性化治療手段，是當前乳腺癌研究領域的熱點。
　　泛素是由76個氨基酸殘基組成的多肽，其介導的蛋白質(zhì)降解途徑受到嚴格的時空調(diào)控。在ATP的作用下，泛素被泛素激活酶(ubiquitin-activating enzyme，E1)激活后轉(zhuǎn)移至泛素偶聯(lián)酶(ubiquitin-conjugating enzyme，E2)，再由泛素連接酶(ubiquitin

4、ligase，E3)將泛素轉(zhuǎn)移到特定的底物上，最后被泛素修飾的底物進入蛋白酶體(proteasome)進行降解。E3泛素連接酶在蛋白質(zhì)降解過程中發(fā)揮著關鍵的作用，決定著反應的特異性。CUL4A是發(fā)現(xiàn)較晚的一類泛素連接酶，與DDB1蛋白及Roc1相互作用構成E3復合體(CUL4A-DDB1-Roc1)。CUL4A在腫瘤中的研究始于乳腺癌，在原發(fā)性乳腺癌中大量擴增或過表達。隨后的研究表明，在鱗狀細胞癌、腎上腺皮質(zhì)癌、神經(jīng)管細胞瘤、肝癌和惡性

5、胸膜間皮瘤中也存在著CUL4A擴增。最近，全基因組SNP數(shù)組分析揭示了在部分肺癌和卵巢癌以及其它實體瘤中也同樣存在CUL4A基因擴增。而且，CUL4A高表達能促進細胞增殖，其表達水平與總生存率和無病生存率有密切相關性，這表明CUL4A的異常調(diào)節(jié)可能促進腫瘤形成。然而，CUL4A是否能夠調(diào)控腫瘤細胞的EMT以及腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移尚未見研究報道。
　　本研究主要集中于CUL4A調(diào)控乳腺癌細胞EMT以及侵襲轉(zhuǎn)移的作用，并深入研究其可能的分子機

6、制，本研究的成功實施不僅豐富了CUL4A在乳腺癌中的生物學功能，而且還為探討新的乳腺癌侵襲轉(zhuǎn)移的治療方法提供了新的研究靶點。
　　第一部分E3泛素連接酶CUL4A與腫瘤轉(zhuǎn)移的相關性研究
　　[目的]
　　應用常見細胞株和組織芯片研究在惡性程度不同的細胞中以及不同腫瘤類型中CUL4A的表達，并分析CUL4A與腫瘤轉(zhuǎn)移的關系，為進一步明確CUL4A在乳腺癌侵襲轉(zhuǎn)移中的作用奠定基礎。
　　[方法]
　　1.應用本

7、實驗室保藏的常見腫瘤細胞株，通過qRT-PCR和Western blot檢測不同細胞株中CUL4A的表達情況。
　　2.應用Biomax生物公司的乳腺癌組織芯片(BR954)，通過免疫組織化學法檢測CUL4A在正常乳腺組織、原位癌組織和具有轉(zhuǎn)移特性的乳腺癌組織中的表達情況。
　　3.應用Biomax生物公司的胃癌組織芯片(ST8041)，通過免疫組織化學法檢測CUL4A在正常胃組織、原位癌和具有轉(zhuǎn)移特性的胃癌組織中的表達情況

8、。
　　4.應用Biomax生物公司的卵巢組織芯片(OV2089)，通過免疫組織化學法檢測CUL4A在正常卵巢組織、原位癌和具有轉(zhuǎn)移特性的卵巢癌組織中的表達情況。
　　5.應用Biomax生物公司的結腸癌組織芯片(C020814)，通過免疫組織化學法檢測CUL4A在正常結腸組織、原位癌和具有轉(zhuǎn)移特性的結腸癌中的表達情況。
　　[結果]
　　1.qRT-PCR結果顯示CUL4AmRNA表達水平在正常乳腺癌上皮細胞中

9、(MCF10A)表達最低，在非侵襲性乳腺癌上皮細胞中(MDA-MB-468、MCF7、HCC1569)表達較高，而在侵襲性乳腺癌細胞中(MDA-MB-231、BT549)表達水平最高。
　　2.Western blot結果顯示在各型細胞株中CUL4A的蛋白表達水平與其mRNA表達水平相一致，即在正常乳腺癌上皮細胞中(MCF10A)表達最低，在非侵襲性乳腺癌上皮細胞中(MDA-MB-468、MCF7、HCC1569)表達較高，而在侵

10、襲性乳腺癌細胞中(MDA-MB-231、BT549)表達最高。
　　3.通過免疫組織化學法檢測乳腺癌組織芯片中CUL4A的蛋白表達結果表明正常乳腺中CUL4A表達較低，原位癌中表達較高，而具有遠處轉(zhuǎn)移的乳腺癌中CUL4A的表達最顯著。
　　4.通過免疫組織化學法檢測胃癌組織芯片中CUL4A的蛋白表達結果表明正常胃組織中CUL4A表達較低，原位癌中表達較高，而具有遠處轉(zhuǎn)移的胃癌中CUL4A的表達最顯著。
　　5.通過免疫

11、組織化學法檢測卵巢癌組織芯片中CUL4A的蛋白表達結果表明正常卵巢組織中CUL4A表達較低，原位癌中表達較高，而具有遠處轉(zhuǎn)移的卵巢癌中CUL4A的表達最顯著。
　　6.通過免疫組織化學法檢測結腸癌組織芯片中CUL4A的蛋白表達結果表明正常結腸組織中CUL4A表達較低，原位癌中表達較高，而具有遠處轉(zhuǎn)移的結腸癌中CUL4A的表達最顯著。
　　[結論]
　　1.CUL4A在各型乳腺細胞株中表達不同，侵襲性強的細胞株中表達高，

12、侵襲性低的表達較低，表明CUL4A表達水平與乳腺癌細胞的侵襲性密切相關。
　　2.不同類型腫瘤的組織芯片免疫組化結果證明，具有轉(zhuǎn)移特性的腫瘤組織中CUL4A表達增加顯著，而原位癌CUL4A表達相對較低，表明CUL4A與腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移具有顯著相關性。
　　第二部分CUL4A促進乳腺癌細胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化及侵襲轉(zhuǎn)移的作用研究
　　[目的]
　　第一部分研究結果提示CUL4A可能具有促進乳腺癌遷移、轉(zhuǎn)移的能力。為此，本部分

13、通過體外細胞實驗和裸鼠體內(nèi)轉(zhuǎn)移模型實驗檢測CUL4A是否具有誘導乳腺癌細胞EMT發(fā)生和遠處轉(zhuǎn)移的作用。
　　[方法]
　　1.通過逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)染pBabe-CUL4A及其空白對照質(zhì)粒，在CUL4A低表達的MDA-MB-468和MCF7細胞系中構建CUL4A過表達的細胞株及其對照(MDA-MB-468-pBabe、MDA-MB-468-pBabe-CUL4A、MCF7-pBabe、MCF7-pBabe-CUL4A)。嘌呤霉素篩

14、選后應用qRT-PCR和Western blot驗證CUL4A表達改變。
　　2.通過逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)染pSuper-shCUL4A及其空白對照質(zhì)粒，在CUL4A表達較高的MDA-MB-231和BT549細胞系中構建CUL4A低表達的細胞株及其對照(MDA-MB-231-pSuper、MDA-MB-231-pSuper-shCUL4A、BT549-pSuper、BT549-pSuper-shCUL4A)。嘌呤霉素篩選后應用qRT-PC

15、R和Westem blot驗證CUL4A表達改變。
　　3.分別應用上述構建成功的CUL4A穩(wěn)定沉默或上調(diào)的細胞株，通過光鏡下觀察細胞形態(tài)以及應用qRT-PCR、Western blot、激光共聚焦結合免疫熒光染色等技術檢測EMT相關標記分子(E-cadherin、α-catenin、N-cadherin、Vimentin等)的表達，觀察CUL4A調(diào)控乳腺癌細胞EMT的作用。
　　4.應用上述構建成功的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細胞株，通過

16、細胞劃痕實驗、Transwell小室遷移實驗檢測CUL4A調(diào)控乳腺癌細胞遷移能力的作用;通過Matrigel侵襲實驗檢測CUL4A調(diào)控乳腺癌細胞侵襲能力的作用。
　　5.應用穩(wěn)定轉(zhuǎn)染高表達CUL4A的乳腺癌細胞株及其空白對照建立裸鼠異種移植瘤模型和遠處轉(zhuǎn)移瘤模型，觀察腫瘤轉(zhuǎn)移情況，研究上調(diào)CUL4A表達是否能夠促進乳腺癌細胞的侵襲轉(zhuǎn)移。
　　6.應用穩(wěn)定轉(zhuǎn)染CUL4A抑制序列的乳腺癌細胞株及其空白對照構建裸鼠異種移植瘤模型和

17、遠處轉(zhuǎn)移瘤模型，觀察腫瘤轉(zhuǎn)移情況，研究下調(diào)CUL4A表達是否能夠抑制乳腺癌細胞的侵襲轉(zhuǎn)移。
　　7.通過qRT-PCR、Western blot以及免疫組織化學染色等方法檢測各組瘤體和轉(zhuǎn)移灶中CUL4A、E-cadherin、和Vimentin等表達的改變，進一步驗證體外實驗所證實的EMT改變。
　　[結果]
　　1.成功構建成穩(wěn)定轉(zhuǎn)染CUL4A的乳腺癌細胞株及其空白對照(MDA-MB-468-pBabe、MDA-MB

18、-468-pBabe-CUL4A、MCF7-pBabe、MCF7-pBabe-CUL4A)。
　　2.成功構建成穩(wěn)定轉(zhuǎn)染CUL4A干擾序列的的乳腺癌細胞株及其空白對照(MDA-MB-231-pSuper、MDA-MB-231-pSuper-shCUL4A、BT549-pSuper、BT549-pSuper-shCUL4A)
　　3.CUL4A促進間質(zhì)細胞標志分子N-cadherin、Vimentin的表達，抑制上皮細胞標志分

19、子E-cadherin、α-catenin的表達。
　　4.CUL4A能夠促進乳腺癌細胞形態(tài)從上皮細胞向間質(zhì)細胞轉(zhuǎn)化。
　　5.CUL4A促進乳腺癌細胞體外運動和侵襲能力。
　　6.體內(nèi)轉(zhuǎn)移瘤實驗表明，CUL4A具有促進乳腺癌細胞體內(nèi)侵襲轉(zhuǎn)移的能力。
　　[結論]
　　1.CUL4A具有調(diào)控乳腺癌上皮細胞發(fā)生EMT的作用。
　　2.體內(nèi)外實驗表明CUL4A能夠促進乳腺癌細胞的運動、侵襲和轉(zhuǎn)移能力。

20、r>　　第三部分CUL4A促進乳腺癌細胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化和侵襲轉(zhuǎn)移作用的分子機制研究
　　[目的]
　　臨床標本檢測以及體內(nèi)外實驗表明CUL4A具有促進乳腺癌細胞EMT和侵襲轉(zhuǎn)移的能力，但其具體的作用機制尚未有文獻報道，本部分主要目的旨在通過系列實驗明確其可能的分子機制。
　　[方法]
　　1.Affymetrix（昂飛）Gene Chip Human U133 Plus 2.0 cartridge基因芯片檢測過表達

21、CUL4A對乳腺癌細胞MDA-MB-468基因表達譜的影響，篩選可能的調(diào)控機制。
　　2.在穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的乳腺癌細胞系中，應用qRT-PCR和Western blot驗證基因芯片結果中與EMT密切相關的轉(zhuǎn)錄因子ZEB1的表達。
　　3.Western blot檢測組蛋白H3甲基化改變情況。
　　4.染色質(zhì)免疫共沉淀結合qPCR技術檢測CUL4A對H3K4me3結合ZEB1啟動子能力的影響。
　　5.在MDA-MB-4

22、68-pBabe-CUL4A細胞中通過逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)染系統(tǒng)，構建穩(wěn)定下調(diào)ZEB1表達的細胞株及其對照。
　　6.Western blot檢測上述細胞中EMT標記分子的改變。
　　7.應用上述構建成功的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細胞株，通過細胞劃痕實驗、Transwell小室遷移實驗檢測細胞遷移能力;通過Matrigel侵襲實驗檢測細胞侵襲能力。
　　8.應用上述構建成功的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細胞株，構建裸鼠異種移植瘤模型和遠處轉(zhuǎn)移瘤模型，觀察腫瘤

23、轉(zhuǎn)移情況，研究下調(diào)ZEB1表達是否能夠阻斷CUL4A介導的乳腺癌細胞侵襲轉(zhuǎn)移。
　　9.應用Biomax生物公司的乳腺癌組織芯片(BR954)，通過免疫組織化學法檢測ZEB1在正常乳腺組織、原位癌和轉(zhuǎn)移癌中的表達情況，并分析ZEB1的表達與CUL4A表達的相關性。
　　[結果]
　　1.基因芯片結果表明CUL4A表達增加能夠顯著促進EMT關鍵調(diào)節(jié)因子ZEB1的表達，qRT-PCR以及Western blot結果同樣也證

24、明在穩(wěn)定轉(zhuǎn)染CUL4A的細胞中CUL4A能夠調(diào)節(jié)ZEB1的表達。
　　2.穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞中的組蛋白H3甲基化位點的檢測表明，CUL4A能夠促進H3K4的三重甲基化(H3K4me3)。
　　3.染色質(zhì)免疫共沉淀結果表明，CUL4A能夠促進H3K4me3與ZEB1基因啟動子的結合。
　　4.干擾ZEB1表達后能夠抑制CUL4A高表達導致的EMT改變。
　　5.干擾ZEB1表達后能夠抑制CUL4A導致的細胞運動和侵襲能力

25、的改變。
　　6.體內(nèi)實驗也表明干擾ZEB1表達后能夠抑制CUL4A導致的乳腺癌細胞體內(nèi)遠處轉(zhuǎn)移能力的改變。
　　7.組織芯片檢測ZEB1表達顯示，在轉(zhuǎn)移性乳腺癌中，ZEB1表達最高，而在正?；蛟话┲衂EB1表達較低。
　　8.相關性分析提示，乳腺癌組織中CUL4A表達與ZEB1的表達呈顯著的正相關性。
　　[結論]
　　1.CUL4A通過促進H3K4的三重甲基化(H3K4me3)，而H3K4me3結合于