放射對乳腺癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移潛能的影響及相關(guān)機(jī)制研究.pdf

1、背景和目的：
　　放射治療可降低乳腺癌患者保乳和乳房切除后的局部復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)，提高生存率，在早期和局部進(jìn)展期乳腺癌治療中發(fā)揮重要作用。然而，近年來研究發(fā)現(xiàn)放射治療還可能通過改變腫瘤微環(huán)境，增加腫瘤細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移潛能。這里我們探討放射后乳腺癌細(xì)胞侵襲及轉(zhuǎn)移潛能的變化及其機(jī)制。
　　材料和方法：
　　1、在體外以不同劑量(0、4、8Gy)X線照射人乳腺癌MDA-MB-435細(xì)胞。明膠酶譜法檢測放射后24h、48h細(xì)胞培養(yǎng)上清液

2、中基質(zhì)金屬蛋白酶MMP-2活性，Western bloting檢測放射后24h、48h細(xì)胞內(nèi)MMP-2蛋白表達(dá)水平，Transwell法測定放射后24h、48h細(xì)胞的侵襲能力，評價放射治療對乳腺癌侵襲潛能的影響及其機(jī)制。
　　2、構(gòu)建同時表達(dá)增強(qiáng)型綠色熒光蛋白(Enhanced Green Fluorecence Protein，eGFP)和熒光素酶(Luciferase，Luc)的慢病毒載體，將GFP-Luciferase融合蛋

3、白載體轉(zhuǎn)染到人乳腺癌MDA-MB-435細(xì)胞株。將穩(wěn)定表達(dá)GPF和1uciferase的MDA-MB-435細(xì)胞（MDA-MB-435-eGFP-Luc）接種裸鼠，建立原位乳腺癌轉(zhuǎn)移動物模型并在接種后第二周分組，放射治療組采用8Gy單次劑量照射原位腫瘤，采用在體流式細(xì)胞儀（In Vivo Flow Cytometry，IVFC）每周檢測裸鼠耳根部動脈循環(huán)腫瘤細(xì)胞（Circulating tumour cells，CTCs），同步采用小動

4、物活體成像系統(tǒng)（In Vivo Image System，IVIS）監(jiān)測腫瘤生長及全身轉(zhuǎn)移情況。接種后第6周處死兩組裸鼠，取出肺組織進(jìn)行活組織成像及病理組織切片HE染色，比較兩組裸鼠肺組織轉(zhuǎn)移灶數(shù)目，并采用免疫組織化學(xué)染色檢測原發(fā)腫瘤組織內(nèi)MMP-2表達(dá)，評價放射治療對乳腺癌轉(zhuǎn)移潛能的影響及其機(jī)制。
　　結(jié)果：
　　1、放射后乳腺癌MDA-MB-435細(xì)胞侵襲能力、MMP-2表達(dá)及活性顯著提高并均呈現(xiàn)時間及劑量依賴性，單次8

5、Gy照射48h達(dá)到最高。
　　2、成功建立了穩(wěn)定表達(dá)GFP／Luciferase的乳腺癌細(xì)胞株：綠色熒光表達(dá)強(qiáng)，GFP轉(zhuǎn)染效率達(dá)到99.58％，體外發(fā)光能力與細(xì)胞數(shù)目呈正相關(guān)(R2=0．998)。腫瘤細(xì)胞接種后第二周IVFC探測到體內(nèi)CTCs信號峰，IVIS成像檢查檢測到肺內(nèi)微小轉(zhuǎn)移灶。腫瘤細(xì)胞的形態(tài)學(xué)特征、生長速度、侵襲及遷移特性與轉(zhuǎn)染前無明顯變化。
　　3、照射組接受放射后腫瘤體積、CTCs數(shù)目、腫瘤部位熒光強(qiáng)度呈現(xiàn)先減

6、小后增加趨勢。放療后第4周（即腫瘤接種后第6周）對照組和實(shí)驗(yàn)組腫瘤體積分別為519.66±32.89mm3,497.28±45.86mm3（p＞0.05）無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，每小時CTCs數(shù)目分別為7.8±1.9，11.8±2.3(p＜0.05)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，提示放療后第4周腫瘤細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移能力獲得進(jìn)一步增強(qiáng)。放射治療組腫瘤組織MMP-2表達(dá)及肺轉(zhuǎn)移灶明顯多于對照組。
　　結(jié)論：
　　1、結(jié)合IVFC和IVIS技術(shù)可以實(shí)現(xiàn)對MDA

7、-MB-435-GFP-Luc細(xì)胞系原位乳腺癌模型的CTCs、腫瘤生長及微小轉(zhuǎn)移灶進(jìn)行早期、實(shí)時動態(tài)監(jiān)測。
　　2、放射線照射能夠通過增強(qiáng)乳腺癌細(xì)胞 MMP-2的表達(dá)或活性而增強(qiáng)其侵襲轉(zhuǎn)移潛能。
　　背景與目的
　　放射治療可降低乳腺癌患者局部復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)，提高生存率，在早期和局部進(jìn)展期乳腺癌治療中發(fā)揮重要作用。然而，近年來研究發(fā)現(xiàn)放射治療還可能通過改變腫瘤細(xì)胞表型或腫瘤微環(huán)境，增加殘存腫瘤的侵襲性，導(dǎo)致轉(zhuǎn)移概率增加。本文

8、研究放射治療對乳腺癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移潛能的影響及機(jī)制。
　　材料與方法
　　1、以不同劑量(O、4、8Gy)6MV X線照射人乳腺癌MDA-MB-435細(xì)胞。明膠酶譜法檢測放射后24h、48h細(xì)胞培養(yǎng)上清液金屬蛋白酶 MMP-2活性，Western bloting檢測放射后24h、48h細(xì)胞內(nèi)MMP-2蛋白表達(dá)，Transwell法測定放射后24h、48h細(xì)胞的侵襲能力。
　　2、將穩(wěn)定表達(dá)的MDA-MB-435-eGFP

9、-Luc細(xì)胞接種裸小鼠，建立原位乳腺癌轉(zhuǎn)移動物模型。接種后第二周，8Gy單次劑量照射原位腫瘤后，采用IVFC每周檢測裸鼠耳根部動脈CTCs，同步采用IVIS監(jiān)測腫瘤生長及全身轉(zhuǎn)移灶。接種后第6周，腹腔注射底物熒光素后立即處死兩組裸鼠，取出肺組織進(jìn)行活組織成像及病理組織切片HE染色，比較兩組裸鼠肺組織轉(zhuǎn)移灶數(shù)目，并采用免疫組織化學(xué)染色檢測原發(fā)腫瘤組織內(nèi)MMP-2表達(dá)，評價放射治療對乳腺癌轉(zhuǎn)移潛能的影響。
　　結(jié)果
　　1、放射

10、對乳腺癌MDA-MB-435細(xì)胞MMP-2表達(dá)及活性影響具有時間及劑量依賴性，單次8Gy照射48h侵襲細(xì)胞數(shù)最多，且MMP-2活性及表達(dá)最高。腫瘤細(xì)胞侵襲性的變化也與MMP-2分泌及活性變化一致。
　　2、放射治療組接受放射后腫瘤體積、CTCs數(shù)目、腫瘤部位熒光強(qiáng)度呈現(xiàn)先減小后增加趨勢。放療后第4周（即腫瘤接種后第6周）對照組和放射治療組腫瘤體積分別為519.66±32.89mm3,497.28±45.86mm3（p＞0.05）無