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文檔簡介
1、目的:
研究GEN1干擾對乳腺癌SKBR3和MCF-7細胞化療敏感性的影響,并探討GEN1干擾在不同乳腺癌細胞中帶來不同效應的相關(guān)機制。
方法:
通過抽提獲得大量高純度shRNA干擾質(zhì)粒和陰性對照質(zhì)粒,經(jīng)實時熒光定量PCR(RT-PCR)檢測干擾效果,篩選最佳干擾質(zhì)粒。利用最佳干擾質(zhì)粒干擾乳腺癌SKBR3和MCF-7細胞中GEN1的表達;RT-PCR和Western blot檢測干擾效果;用新型四唑單鈉鹽試
2、劑盒(CCK-8)檢測不同5-氟尿嘧啶(5-FU)濃度及IC50濃度下實驗組和對照組細胞存活率;用AnnexinⅤ-FITC細胞凋亡檢測試劑盒檢測5-FU作用下實驗組和對照組細胞凋亡水平變化,研究GEN1干擾對乳腺癌SKBR3和MCF-7細胞化療敏感性的影響。將Mus81高表達的MCF-7細胞進行GEN1和Mus81同時干擾,CCK-8細胞存活率實驗檢測實驗組和對照組細胞存活率的變化;用低濃度5-氟尿嘧啶(5-FU)處理sh-Mus81
3、單干擾組和陰性對照組MCF-7細胞96 h,實時熒光定量PCR和Western blot檢測MCF-7細胞中GEN1和Mus81表達水平變化;用低濃度5-FU處理正常SKBR3和MCF-7細胞96 h,Westernblot檢測處理前后細胞中GEN1表達水平變化,探討GEN1干擾在不同乳腺癌中帶來不同效應的相關(guān)機制。
結(jié)果:
1.抽提的shRNA干擾質(zhì)粒及陰性對照質(zhì)粒經(jīng)測定后濃度和純度均達到要求,可以進行后續(xù)實驗。R
4、T-PCR結(jié)果表明:3號GEN1和2號Mus81干擾質(zhì)粒干擾效果最佳。
2.利用最佳干擾質(zhì)粒干擾乳腺癌SKBR3和MCF-7細胞中GEN1的表達后,RT-PCR和Western blot證明GEN1干擾效果良好;CCK-8細胞存活率實驗表明:實驗組SKBR3細胞存活率較對照組明顯降低(P<0.05);實驗組MCF-7細胞存活率較對照組無明顯變化(P>0.05); AnnexinⅤ-FITC細胞凋亡實驗顯示:實驗組SKBR3細胞
5、凋亡水平較對照組明顯增高(P<0.05);實驗組MCF-7細胞凋亡水平較對照組無明顯變化(P>0.05)。以上結(jié)果表明,GEN1干擾可以顯著提高SKBR3對5-FU的化療敏感性,但對MCF-7對5-FU的化療敏感性無明顯影響,相關(guān)機制有待于進一步研究。
3.同時干擾GEN1和Mus81后,MCF-7對5-FU的化療敏感性明顯增強(P<0.05);在低濃度5-FU持續(xù)作用下,sh-Mus81組MCF-7細胞中GEN1表達水平明顯
6、提高(P<0.05);在低濃度5-FU持續(xù)作用下,SKBR3細胞中GEN1水平明顯提高(P<0.05),而MCF-7細胞中GEN1水平未見明顯變化(P>0.05)。以上結(jié)果表明,GEN1干擾對乳腺癌細胞化療敏感性的影響,同Mus81的表達水平密切相關(guān)。在Mus81高表達時,GEN1干擾對藥敏沒有明顯影響;當Mus81表達降低時,干擾GEN1可以明顯提高乳腺癌對5-FU的化療敏感性。
結(jié)論:
GEN1干擾可以明顯增強S
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