TGF-β1在乳腺癌細胞中對Pokemon表達的影響及機制初步研究.pdf

1、目的：揭示TGF–β1在乳腺癌細胞中對Pokemon表達的影響，并初步闡明其相關(guān)分子機制。
　　方法：以MCF-7和MDA-MB-231兩種乳腺癌細胞為研究對象，研究了TGF–β1在乳腺癌細胞中對 Pokemon表達的影響及相關(guān)分子機制。實驗分為三部分：第一部分研究 TGF–β1在乳腺癌細胞中對 Pokemon表達的影響。乳腺癌細胞以不同濃度的TGF–β1處理一定時間或者以一定濃度的TGF–β1處理不同時間，然后應用RT-PCR、

2、免疫熒光及Western blot方法檢測乳腺癌細胞中Pokemon的表達情況。第二部分研究 TGF–β1在乳腺癌細胞中對 Pokemon表達影響的相關(guān)分子機制。實驗應用了PI3K/Akt信號通路抑制劑LY294002來驗證TGF–β1在乳腺癌細胞中對Pokemon表達影響的相關(guān)分子機制，PI3K/Akt信號通路可能對TGF–β1在乳腺癌細胞中對Pokemon表達的影響起著重要作用。乳腺癌細胞先以PI3K/Akt信號通路抑制劑LY294

3、002處理2h,再以TGF–β1處理9h，應用RT-PCR、免疫熒光技術(shù)檢測Pokemon的表達情況。同時使用了Western blot方法直接檢測經(jīng)TGF–β1處理過的乳腺癌細胞中Pokemon、AKT及P-Akt的表達。第三部分研究TGF–β1在乳腺癌細胞中對Pokemon啟動子活性的影響。以不同濃度的TGF–β1處理轉(zhuǎn)染了 Pokemon啟動子質(zhì)粒的乳腺癌細胞，然后應用雙熒光素酶報告基因測定Pokemon的啟動子活性。
　　

4、結(jié)果：1）TGF–β1在乳腺癌細胞中對Pokemon表達的影響。①RT-PCR結(jié)果：量效研究：在MCF-7細胞中，與對照組相比，加入TGF–β1后Pokemon mRNA轉(zhuǎn)錄水平表達升高，且以5ng/ml TGF–β1組的升高幅度最為明顯（P<0.01）；時效研究：在MCF-7細胞中，與0h組相比，加入TGF–β1后,隨著作用時間的延長，Pokemon mRNA轉(zhuǎn)錄水平表達升高，且以12hTGF–β1組的升高幅度最為明顯（P<0.01）

5、。②細胞免疫熒光結(jié)果：量效研究：在MCF-7和MDA-MB-231細胞中，與對照組相比，加入 TGF–β1后 Pokemon表達的平均熒光強度升高，且均以5ng/ml TGF–β1組平均熒光強度升高最為明顯，在MCF-7細胞中（P<0.01），在MDA-MB-231細胞中（P<0.05）。時效研究：在MCF-7和MDA-MB-231細胞中，與0h組相比，加入 TGF–β1后,隨著作用時間的延長，Pokemon表達的平均熒光強度升高，且均

6、以4h TGF–β1組的升高幅度最為明顯，在MCF-7細胞中（P<0.01），在MDA-MB-231細胞中（P<0.05）。③Western blot結(jié)果：量效研究：在MCF-7細胞中，與對照組相比，加入TGF–β1后Pokemon蛋白水平的表達升高，且以5ng/ml TGF–β1組的升高幅度最為明顯（P<0.01）。2）PI3K/Akt信號通路對TGF–β1在乳腺癌細胞中對Pokemon表達的作用研究。①RT-PCR結(jié)果：在MCF-7

7、細胞中，加入PI3K/Akt信號通路的抑制劑LY294002（濃度分別為10μM和20μM）后，Pokemon mRNA轉(zhuǎn)錄水平明顯受到抑制（P<0.05）。②細胞免疫熒光結(jié)果：在MCF-7和MDA-MB-231細胞中，加入PI3K/Akt信號通路的抑制劑LY294002（濃度為10μM），與對照組相比，10ng/ml TGF–β1處理組Pokemon平均熒光強度升高（P<0.05）。與10ng/ml TGF–β1處理組相比，加入PI3

8、K/Akt信號通路抑制劑 LY294002（濃度為10μM），Pokemon表達的平均熒光強度明顯受到抑制（P<0.05）。表明 TGF–β1在乳腺癌細胞中對 Pokemon表達的影響可能與PI3K/Akt信號通路有關(guān)系。③Western blot結(jié)果：時效研究：在MCF-7和MDA-MB-231細胞中，與0h組相比，加入TGF–β1后，在觀察的時間范圍內(nèi)，隨著作用時間的延長，Pokemon蛋白水平表達升高，且以6h組升高幅度最為明顯（

9、P<0.01）；Akt蛋白水平的表達無明顯變化，而Akt蛋白磷酸化水平的表達呈現(xiàn)一個先升高后降低的趨勢，在MCF-7細胞中，當作用時間為30min時達最高（P<0.01），在MDA-MB-231細胞中，當作用時間為1h時達最高（P<0.01），后隨著作用時間的延長，Akt蛋白磷酸化水平的表達又開始下降，在觀察的時間內(nèi)，在MCF-7細胞中，與30min組相比較，以6h組下降最為明顯（P<0.01），在MDA-MB-231細胞中，與1h組相