TGF-β1在乳腺癌細(xì)胞中對(duì)Pokemon表達(dá)的影響及機(jī)制初步研究.pdf

1、目的：揭示TGF–β1在乳腺癌細(xì)胞中對(duì)Pokemon表達(dá)的影響，并初步闡明其相關(guān)分子機(jī)制。
　　方法：以MCF-7和MDA-MB-231兩種乳腺癌細(xì)胞為研究對(duì)象，研究了TGF–β1在乳腺癌細(xì)胞中對(duì) Pokemon表達(dá)的影響及相關(guān)分子機(jī)制。實(shí)驗(yàn)分為三部分：第一部分研究 TGF–β1在乳腺癌細(xì)胞中對(duì) Pokemon表達(dá)的影響。乳腺癌細(xì)胞以不同濃度的TGF–β1處理一定時(shí)間或者以一定濃度的TGF–β1處理不同時(shí)間，然后應(yīng)用RT-PCR、

2、免疫熒光及Western blot方法檢測(cè)乳腺癌細(xì)胞中Pokemon的表達(dá)情況。第二部分研究 TGF–β1在乳腺癌細(xì)胞中對(duì) Pokemon表達(dá)影響的相關(guān)分子機(jī)制。實(shí)驗(yàn)應(yīng)用了PI3K/Akt信號(hào)通路抑制劑LY294002來(lái)驗(yàn)證TGF–β1在乳腺癌細(xì)胞中對(duì)Pokemon表達(dá)影響的相關(guān)分子機(jī)制，PI3K/Akt信號(hào)通路可能對(duì)TGF–β1在乳腺癌細(xì)胞中對(duì)Pokemon表達(dá)的影響起著重要作用。乳腺癌細(xì)胞先以PI3K/Akt信號(hào)通路抑制劑LY294

3、002處理2h,再以TGF–β1處理9h，應(yīng)用RT-PCR、免疫熒光技術(shù)檢測(cè)Pokemon的表達(dá)情況。同時(shí)使用了Western blot方法直接檢測(cè)經(jīng)TGF–β1處理過(guò)的乳腺癌細(xì)胞中Pokemon、AKT及P-Akt的表達(dá)。第三部分研究TGF–β1在乳腺癌細(xì)胞中對(duì)Pokemon啟動(dòng)子活性的影響。以不同濃度的TGF–β1處理轉(zhuǎn)染了 Pokemon啟動(dòng)子質(zhì)粒的乳腺癌細(xì)胞，然后應(yīng)用雙熒光素酶報(bào)告基因測(cè)定Pokemon的啟動(dòng)子活性。
　　

4、結(jié)果：1）TGF–β1在乳腺癌細(xì)胞中對(duì)Pokemon表達(dá)的影響。①RT-PCR結(jié)果：量效研究：在MCF-7細(xì)胞中，與對(duì)照組相比，加入TGF–β1后Pokemon mRNA轉(zhuǎn)錄水平表達(dá)升高，且以5ng/ml TGF–β1組的升高幅度最為明顯（P<0.01）；時(shí)效研究：在MCF-7細(xì)胞中，與0h組相比，加入TGF–β1后,隨著作用時(shí)間的延長(zhǎng)，Pokemon mRNA轉(zhuǎn)錄水平表達(dá)升高，且以12hTGF–β1組的升高幅度最為明顯（P<0.01）

5、。②細(xì)胞免疫熒光結(jié)果：量效研究：在MCF-7和MDA-MB-231細(xì)胞中，與對(duì)照組相比，加入 TGF–β1后 Pokemon表達(dá)的平均熒光強(qiáng)度升高，且均以5ng/ml TGF–β1組平均熒光強(qiáng)度升高最為明顯，在MCF-7細(xì)胞中（P<0.01），在MDA-MB-231細(xì)胞中（P<0.05）。時(shí)效研究：在MCF-7和MDA-MB-231細(xì)胞中，與0h組相比，加入 TGF–β1后,隨著作用時(shí)間的延長(zhǎng)，Pokemon表達(dá)的平均熒光強(qiáng)度升高，且均

6、以4h TGF–β1組的升高幅度最為明顯，在MCF-7細(xì)胞中（P<0.01），在MDA-MB-231細(xì)胞中（P<0.05）。③Western blot結(jié)果：量效研究：在MCF-7細(xì)胞中，與對(duì)照組相比，加入TGF–β1后Pokemon蛋白水平的表達(dá)升高，且以5ng/ml TGF–β1組的升高幅度最為明顯（P<0.01）。2）PI3K/Akt信號(hào)通路對(duì)TGF–β1在乳腺癌細(xì)胞中對(duì)Pokemon表達(dá)的作用研究。①RT-PCR結(jié)果：在MCF-7

7、細(xì)胞中，加入PI3K/Akt信號(hào)通路的抑制劑LY294002（濃度分別為10μM和20μM）后，Pokemon mRNA轉(zhuǎn)錄水平明顯受到抑制（P<0.05）。②細(xì)胞免疫熒光結(jié)果：在MCF-7和MDA-MB-231細(xì)胞中，加入PI3K/Akt信號(hào)通路的抑制劑LY294002（濃度為10μM），與對(duì)照組相比，10ng/ml TGF–β1處理組Pokemon平均熒光強(qiáng)度升高（P<0.05）。與10ng/ml TGF–β1處理組相比，加入PI3

8、K/Akt信號(hào)通路抑制劑 LY294002（濃度為10μM），Pokemon表達(dá)的平均熒光強(qiáng)度明顯受到抑制（P<0.05）。表明 TGF–β1在乳腺癌細(xì)胞中對(duì) Pokemon表達(dá)的影響可能與PI3K/Akt信號(hào)通路有關(guān)系。③Western blot結(jié)果：時(shí)效研究：在MCF-7和MDA-MB-231細(xì)胞中，與0h組相比，加入TGF–β1后，在觀察的時(shí)間范圍內(nèi)，隨著作用時(shí)間的延長(zhǎng)，Pokemon蛋白水平表達(dá)升高，且以6h組升高幅度最為明顯（

9、P<0.01）；Akt蛋白水平的表達(dá)無(wú)明顯變化，而Akt蛋白磷酸化水平的表達(dá)呈現(xiàn)一個(gè)先升高后降低的趨勢(shì)，在MCF-7細(xì)胞中，當(dāng)作用時(shí)間為30min時(shí)達(dá)最高（P<0.01），在MDA-MB-231細(xì)胞中，當(dāng)作用時(shí)間為1h時(shí)達(dá)最高（P<0.01），后隨著作用時(shí)間的延長(zhǎng)，Akt蛋白磷酸化水平的表達(dá)又開(kāi)始下降，在觀察的時(shí)間內(nèi)，在MCF-7細(xì)胞中，與30min組相比較，以6h組下降最為明顯（P<0.01），在MDA-MB-231細(xì)胞中，與1h組相