Cx43通過抑制EMT逆轉(zhuǎn)人肺腺癌細胞A549對順鉑的獲得性耐藥.pdf

1、目的：
　　觀察Cx43對人肺腺癌細胞A549的獲得性耐藥的影響，以及與上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）的關(guān)系。
　　方法：
　　采用MTT法確定耐藥株，用不同濃度的順鉑（0，20，40，80，160，320μM）分別作用人肺腺癌敏感株（A549）和人肺腺癌耐順鉑耐藥株（A549/CDDP）48h后測定細胞存活率，確定耐藥指數(shù)。
　　1.采用Western

2、 blotting法檢測A549和A549/CDDP中Cx43及EMT標(biāo)志蛋白上皮鈣粘附素（E-cadherin）、波形蛋白（Vimentin）、轉(zhuǎn)錄因子Snail，Slug的表達，及干擾和過表達Cx43后EMT相關(guān)蛋白的表達。
　　2.采用SiRNA小干擾的方法下調(diào)Cx43的表達，用過表達方法上調(diào)Cx43的表達。
　　3.采用Transwell法檢測A549和A549/CDDP的侵襲能力，以及干擾或過表達Cx43后細胞的侵

3、襲能力。
　　4.采用劃痕實驗來檢測 A549和 A549/CDDP的轉(zhuǎn)移能力，以及干擾或過表達Cx43后細胞的轉(zhuǎn)移能力。
　　5.統(tǒng)計學(xué)方法：組間數(shù)據(jù)分析采用SPSS13.0軟件進行t檢驗。
　　結(jié)果：
　　1.耐藥株的鑒定
　　M TT結(jié)果顯示：A549/CDDP的IC50=311.2μM，A549的IC50=53.6μM，RI=5.8，結(jié)果顯示A549/CDDP對順鉑產(chǎn)生了獲得性耐藥。
　　2.

4、A549/CDDP細胞與A549細胞相比發(fā)生了EMT轉(zhuǎn)化
　　Western blotting的結(jié)果顯示與A549相比A549/CDDP細胞中的上皮標(biāo)志蛋白E-cadherin的表達顯著降低，而間質(zhì)標(biāo)志蛋白Vimentin的表達顯著增強，轉(zhuǎn)錄因子Snail、Slug的表達也顯著增強。
　　3.與A549細胞相比A549/CDDP細胞的侵襲轉(zhuǎn)移能力顯著增強
　　細胞侵襲轉(zhuǎn)移能力的獲得是EMT改變的重要標(biāo)志，Transwe

5、ll和劃痕的實驗結(jié)果表明，與A549相比A549/CDDP細胞的侵襲轉(zhuǎn)移能力顯著增強。
　　4.與A549細胞相比A549/CDDP細胞中Cx43的表達量顯著降低
　　Western blotting結(jié)果表明，與A549相比A549/CDDP細胞中的Cx43的表達量顯著降低，此差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　5.上調(diào)Cx43的表達可逆轉(zhuǎn)A549/CDDP細胞的EMT轉(zhuǎn)化
　　采用過表達技術(shù)將含目的基因的質(zhì)粒（pcDNA

6、-Cx43）與空質(zhì)粒（pcDNA）分別轉(zhuǎn)染進入A549/CDDP細胞中，在顯微鏡下觀察細胞形態(tài)發(fā)現(xiàn)與pcDNA相比pcDNA-Cx43組過表達Cx43后細胞的形態(tài)重新變得圓潤，細胞間粘附增強；Western blotting結(jié)果顯示：與pcDNA相比pcDNA-Cx43組過表達Cx43后E-cadherin的表達顯著增強而間質(zhì)標(biāo)志蛋白Vimentin的表達顯著降低，轉(zhuǎn)錄因子Snail, Slug的表達也顯著降低。
　　6.下調(diào)Cx

7、43的表達可誘導(dǎo)A549細胞發(fā)生EMT轉(zhuǎn)化
　　采用基因敲除技術(shù)將含目的基因的小干擾片段（siRNA-Cx43）與空質(zhì)粒（NC）分別轉(zhuǎn)染進入A549細胞中在，在A549細胞中沉默Cx43的表達后，Western Blottin結(jié)果顯示：與NC組相比siRNA-Cx43的E-cadherin的表達顯著降低而間質(zhì)標(biāo)志蛋白Vimentin的表達顯著增強，轉(zhuǎn)錄因子Snail, Slug的表達也顯著增強。
　　7.Cx43可調(diào)控人肺腺

8、癌細胞的侵襲轉(zhuǎn)移能力
　　Transwell實驗和劃痕的實驗結(jié)果表明在A549/CDDP細胞中過表達Cx43后，侵襲轉(zhuǎn)移能力顯著降低；Transwell實驗和劃痕的實驗結(jié)果表明在A549/CDDP細胞中沉默Cx43的表達后，侵襲轉(zhuǎn)移能力顯著增強。
　　8.Cx43可調(diào)控人肺腺癌細胞對順鉑的敏感性
　　結(jié)果顯示，在A549/CDDP細胞中過表達Cx43后，對CDDP的敏感性顯著增強；在A549細胞中干擾Cx43后，對CD