Nrf2及其靶基因在人肺腺癌A549順鉑耐藥細胞株中的表達和意義.pdf

1、研究背景:肺癌在全世界范圍內(nèi)的發(fā)病率和病死率居惡性腫瘤之首,其發(fā)病率逐年升高,嚴重影響著人類的生命健康。由于腫瘤異質(zhì)性的存在,不同個體及腫瘤細胞的生物學活性存在很大差異,不同肺癌細胞對抗癌藥物的敏感性也不完全相同?；瘜W治療是肺癌綜合治療的重要手段之一,但在化學治療中卻存在對正常組織細胞損傷的毒副作用,為了提高化療藥物對腫瘤細胞的敏感性及治療效果,減輕化療藥物對機體的毒副反應,有必要探討不同腫瘤細胞對化療藥物的敏感性或耐藥性的分子生物學機

2、制,為今后腫瘤的個體化治療提供理論依據(jù)。NF-E2相關(guān)因子2(NF-E2-related factor2,Nrf2)是調(diào)節(jié)正常細胞產(chǎn)生保護性的應答反應,抵御外界不良應激刺激的關(guān)鍵的轉(zhuǎn)錄因子,包括順鉑在內(nèi)的化療藥物對腫瘤細胞而言是不良刺激,在這種情況下轉(zhuǎn)錄因子Nrf2是否發(fā)揮對腫瘤細胞的保護作用,介導腫瘤耐藥所涉及到的具體機制值得探討。國外有研究表明Nrf2與腫瘤順鉑耐藥有關(guān),這已在卵巢癌中得以證實:Cho等人阻斷Nrf2后發(fā)現(xiàn)耐順鉑的人

3、卵巢癌SK-OV細胞株對順鉑的敏感性增加。然而Nrf2與肺腺癌順鉑耐藥相關(guān)性的研究目前國內(nèi)未見報道。該研究是初步探討Nrf2與肺腺癌順鉑耐藥的關(guān)系及可能的腫瘤耐藥機制,為今后給予相應的干預措施逆轉(zhuǎn)肺腺癌耐藥、提高化療效果提供新的理論依據(jù)。
　　 目的:該研究旨在測定轉(zhuǎn)錄因子Nrf2及其靶基因在人肺腺癌順鉑耐藥細胞株(A549/DDP)及其親本細胞株(A549)中的定量表達,從Nrf2信號傳導通路角度研究肺腺癌順鉑耐藥的機制,從而

4、為個體化治療及從基因水平開發(fā)新的耐藥拮抗劑提供新的理論依據(jù)。
　　 材料與方法:
　　 1.人肺腺癌A549細胞是經(jīng)手術(shù)標本傳代培養(yǎng)獲得,人肺腺癌順鉑耐藥細胞系(A549/DDP)是在體外經(jīng)小劑量順鉑逐漸加量誘導親本細胞A549獲得的,均由天津市肺癌研究所提供。兩株細胞分別用含10％小牛血清、青霉素和鏈霉素各100u/ml的RPMI-1640培養(yǎng)基于37℃、5％CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng),0.125％胰蛋白酶消化傳代。實

5、驗所用細胞均處于對數(shù)生長期。
　　 2.用MTT法檢測A549/DDP細胞的耐藥性,求出耐藥指數(shù)。
　　 3.采用Real-time PCR法檢測目的基因的定量表達:實驗分兩組:A549細胞組、A549/DDP細胞組。取出等量(1×106)的細胞,抽提細胞總RNA、逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA、Real-time PCR檢測兩組細胞中轉(zhuǎn)錄因子Nrf2、其信號傳導通路相關(guān)基因Keap1及靶基因:GCL、NQO1、GSTP1、HO-1

6、、MRP1、MRP2、MRP3及MRP4的定量表達,最后采用獨立樣本t檢驗分別對兩組間各個基因的表達量進行比較。
　　 結(jié)果：
　　 1.細胞形態(tài)比較:倒置顯微鏡下A549細胞及A549/DDP細胞均貼壁生長良好,A549細胞較小,類圓形不規(guī)則,A549/DDP細胞在DDP刺激下細胞形態(tài)變得較大,呈長梭形,少數(shù)為三角細胞形態(tài)。
　　 2.本實驗所用A549/DDP和A549細胞具有高度同源性,A549/DDP經(jīng)凍

7、存再復蘇后耐藥性質(zhì)穩(wěn)定。經(jīng)3次獨立重復MTT實驗,結(jié)果表明:DDP藥物濃度分別與A549/DDP細胞和親本細胞生長抑制率成正相關(guān),IC50分別為(8.36±0.44)ug/ml、(0.69±0.09)ug/ml,A549/DDP細胞的耐藥指數(shù)為親本細胞的12.12倍,屬于中度耐藥細胞。
　　 3.Realtime PCR結(jié)果提示,耐藥細胞株A549/DDP與敏感株A549相比轉(zhuǎn)錄因子Nrf2的表達量增加,差異有統(tǒng)計學意義。同時伴

8、侶分子Keap1、轉(zhuǎn)錄因子Nrf2的靶基因NQO1、GSTP1、GCL、HO-1、MRP4的mRNA表達增加,MRP1、MRP2及MRP3的mRNA表達降低,差別均有統(tǒng)計學意義。
　　 結(jié)論：人肺腺癌A549順鉑耐藥現(xiàn)象的產(chǎn)生可能與Keap1、轉(zhuǎn)錄因子Nrf2及其靶基因HO-1、GCL、MRP4、GSTP1、NQO1的高表達有關(guān),這些靶基因通過各自或聯(lián)合的作用降低肺腺癌細胞凋亡、加速順鉑代謝、改變藥物在細胞內(nèi)的分布使順鉑遠離作用