ERβ1通過E-鈣粘蛋白影響乳腺癌細(xì)胞侵襲遷移的初步實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、乳腺癌是女性人群中最常見的惡性腫瘤和主要的致死原因。乳腺癌細(xì)胞中雌激素受體表達(dá)情況與治療和預(yù)后相關(guān)。雌激素可通過結(jié)合并活化雌激素受體(Estrogen Receptor,ER),激發(fā)一系列復(fù)雜的信號通路從而發(fā)揮多種生物學(xué)作用。雌激素受體是核受體超家族成員,主要分α、β和γ三種。ERα的功能已較清楚,在日常工作中提到的雌激素受體即指ERα;ERγ的研究相對較少;而ERβ的結(jié)構(gòu)和功能是近年研究的熱點(diǎn)之一。ERβ1是野生全長型ERβ,且是唯一

2、的功能型受體。ERβ1在雌激素的作用下同自身或其它亞型形成二聚體而發(fā)揮作用,而 ERβ的其他亞型如 ERβ2、4等則不能形成二聚體且自身無活性。
　　基礎(chǔ)研究發(fā)現(xiàn) ERβ具有抑制增殖的作用,臨床研究顯示 ERβ在多種上皮性惡性腫瘤,如前列腺癌、乳腺癌、肺癌、卵巢癌等表達(dá)降低甚至缺失,而腫瘤高表達(dá)ERβ的患者有較好的預(yù)后轉(zhuǎn)歸。因此認(rèn)為ERβ在惡性腫瘤中發(fā)揮抑癌基因的作用。但具體的機(jī)制及信號通路尚不清楚。
　　上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(Ep

3、ithelial-Mesenchymal Transition,EMT)在上皮性腫瘤轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮著重要作用。其中E-鈣粘蛋白(E-cadherin,E-cad)的表達(dá)下調(diào)是EMT發(fā)生中最重要的分子事件。在乳腺癌細(xì)胞模型上研究表明,ERα能通過下調(diào)slug的表達(dá)進(jìn)而上調(diào)E-cad表達(dá),抑制EMT的發(fā)生。但在乳腺癌方面上尚未有ERβ表達(dá)和EMT的關(guān)系研究報道。
　　本課題就乳腺癌ERβ與EMT的關(guān)系展開初步實(shí)驗(yàn)研究。通過臨床乳腺癌組

4、織標(biāo)本及體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)探究ERβ1與E-cad的表達(dá)調(diào)節(jié)關(guān)系,初步揭示乳腺癌ERβ1表達(dá)在EMT中的作用,為進(jìn)一步闡明ERβ在乳腺癌中的生物學(xué)行為機(jī)制提供依據(jù)。
　　研究方法和主要結(jié)果:
　　1.ERβ1在人乳腺癌組織標(biāo)本中的表達(dá)及其與E-鈣粘蛋白表達(dá)相關(guān)性分析
　　方法:收集131例人非特殊浸潤性乳腺癌患者組織標(biāo)本和臨床病理信息。采用組織芯片和免疫組化染色的方法,檢測乳腺癌組織中的ERβ1及E-cadherin的蛋白表

5、達(dá)。采用 spss17.0軟件,分析 ERβ1的表達(dá)與患者病理參數(shù)之間的關(guān)聯(lián),以及 ERβ1與E-cadherin表達(dá)相關(guān)性。
　　結(jié)果:在131例人非特殊浸潤性乳腺癌患者組織標(biāo)本中,ERβ1的表達(dá)(-)、(+)、(++)的例數(shù)分別為53例、67例和11例,ERβ1總表達(dá)率為59.5％(78/131)。E-cad表達(dá)(-)、(+)、(++)的例數(shù)分別為46例、44例和41例,E-cad的總表達(dá)率為64.9%(85/131)。其中4

6、7.3%(62/131)的病例同時表達(dá)ERβ1和E-cad。統(tǒng)計分析采用Spearman等級相關(guān)分析ERβ1與E-cad兩者表達(dá),相關(guān)系數(shù)r=0.456,P<0.000,顯示兩者在乳腺非特殊浸潤癌中表達(dá)呈正相關(guān)。
　　ERβ1表達(dá)與組織學(xué)分級有關(guān)(P<0.05),組織學(xué)分級越高,ERβ1的表達(dá)缺失越多。ERβ1的表達(dá)與患者的年齡、月經(jīng)狀況、腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、ERα、PR以及Her-2的表達(dá)無關(guān)。
　　2.人乳腺癌細(xì)胞MD

7、A-MB-231中ERβ1對E-鈣粘蛋白表達(dá)影響
　　方法:采用質(zhì)粒瞬時轉(zhuǎn)染過表達(dá)以及 siRNA干擾的方法,處理人乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231,使其高表達(dá)和降低表達(dá)ERβ1。收集轉(zhuǎn)染48小時后的處理細(xì)胞,分為4組,分別為空白對照組、陰性對照組(僅加入脂質(zhì)體)、ERβ1干擾組和 ERβ1過表達(dá)組。采用RT-PCR以及WB的方法,分別檢測各組細(xì)胞中ERβ1和E-cadherin的mRNA和蛋白水平的表達(dá),并對灰度值做統(tǒng)計分析。

8、r>　　結(jié)果:空白對照組和陰性對照組之間兩個指標(biāo)在基因和蛋白水平表達(dá)沒有差異(p>0.05)。但較之對照組,ERβ1干擾組的ERβ1和E-cadherin的mRNA和蛋白水平的表達(dá)均降低,說明干擾ERβ1RNA能使E-cadherin表達(dá)降低。ERβ1過表達(dá)組ERβ1和E-cadherin的mRNA和蛋白水平的表達(dá)均升高,說明質(zhì)粒轉(zhuǎn)染高表達(dá)有效,且相應(yīng)的影響E-cadherin表達(dá)升高。以上差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

9、　　3.干預(yù)人乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231中ERβ1的表達(dá)對細(xì)胞侵襲和遷移能力的影響
　　方法:采用質(zhì)粒瞬時轉(zhuǎn)染過表達(dá)以及 siRNA干擾的方法,處理人乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231,使其高表達(dá)ERβ1或降低ERβ1表達(dá)。收集轉(zhuǎn)染48小時后的處理細(xì)胞,分為4組,分別為空白對照組、陰性對照組(僅加入脂質(zhì)體)、ERβ1干擾組和 ERβ1過表達(dá)組。采用Transwell小室及BD Matrigel,分別培養(yǎng)后固定,染色,計數(shù)穿出小室的

10、細(xì)胞數(shù),統(tǒng)計分析。
　　結(jié)果:在遷移和侵襲實(shí)驗(yàn)中,空白對照組和陰性對照組之間穿膜細(xì)胞數(shù)沒有差異(p>0.05)。但與對照組比較,ERβ1干擾組的穿膜細(xì)胞數(shù)在遷移和侵襲實(shí)驗(yàn)中均升高,說明ERβ1及E-cadherin的表達(dá)降低增強(qiáng)了乳腺癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力。ERβ1過表達(dá)組中的穿膜細(xì)胞數(shù)在兩組實(shí)驗(yàn)中均降低,說明高表達(dá)ERβ1使E-cadherin的表達(dá)變化,從而降低了細(xì)胞的遷移和侵襲能力。以上差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。