MTBP通過增強MDM2調(diào)節(jié)e-鈣黏蛋白的降解促進肝癌細胞的侵襲和遷移.pdf

1、目的:
　　肝細胞性肝癌(Hepatocellular carcinoma，HCC)在目前癌癥死亡率中排名第二位，手術(shù)切除是治療肝癌的主要方法[1]。然而，多數(shù)患者從就診到確診為肝癌時已是中晚期，喪失了根治性手術(shù)治療的機會，僅有不足20％的患者能及時進行根治性的手術(shù)切除。這主要是因為肝癌細胞的惡性程度高、發(fā)生轉(zhuǎn)移早、呈快速浸潤性生長所導致的。因此，研究調(diào)控肝癌侵襲轉(zhuǎn)移的分子機制，尋找有效的防治靶點已成為肝癌治療領(lǐng)域研究的一個關(guān)鍵性

2、問題[2-3]。
　　最新研究證實MTBP可影響到腫瘤生長的許多方面，主要包括細胞增殖、遷移、侵襲、凋亡及耐藥基因的表達等。研究發(fā)現(xiàn)MTBP在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起著重要的作用，但其對肝細胞癌(HCC)的影響尚不清楚。我們首先發(fā)現(xiàn)MTBP蛋白高表達與遠處轉(zhuǎn)移、肝癌患者的預后不良情況相關(guān)。MTBP在轉(zhuǎn)移性細胞系的表達與非轉(zhuǎn)移性細胞系相比增加。與這些發(fā)現(xiàn)一致，MTBP的表達增強，促進肝癌細胞侵襲和轉(zhuǎn)移在體外和在體內(nèi)，而利用小干擾RNA片段

3、沉默MTBP導致肝癌遷移和侵襲能力降低。在腫瘤進展中，腫瘤細胞獲得的間充質(zhì)標志物的表達和丟失的上皮標志物的表達，從而導致上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)和隨后的腫瘤轉(zhuǎn)移。E-鈣粘蛋白(E-cadherin)的下調(diào)被證實是EMT的標志，并有研究報道與惡性上皮癌的發(fā)展有著密切的關(guān)系。我們前期通過基因芯片篩選在肝癌細胞中降低MTBP表達可導致E-cadherin表達升高。肝癌是一種侵襲和轉(zhuǎn)移能力強的腫瘤，所以我們推測MTBP可能通過調(diào)控E-cadhe

4、rin的表達從而影響肝癌細胞侵襲和轉(zhuǎn)移。本研究擬先檢測MTBP在肝癌組織中的表達并分析在肝癌患者中MTBP的表達與其生存率相關(guān)性;其次通過體外和體內(nèi)研究明確MTBP調(diào)控E-cadherin表達對肝癌細胞侵襲和遷移能力的影響;最后探討MTBP調(diào)控E-cadherin的分子生物學機制。
　　方法:
　　1、通過運用RT-PCR、Western blot、免疫組化等方法檢測120例肝癌組織及癌旁組織MTBP的表達水平，并運用Kap

5、lan-Meier分析MTBP的表達與肝癌患者和復發(fā)肝癌患者的生存率的關(guān)系;
　　2、觀察改變肝癌細胞中MTBP的表達，運用Western blot檢測細胞中MTBP蛋白表達變化，同時利用劃痕實驗、Transwell和裸鼠成瘤實驗觀察肝癌細胞侵襲和轉(zhuǎn)移能力的變化;
　　3、通過運用Western blot等方法檢測改變肝癌細胞中MTBP的表達后E-cadherin蛋白的表達水平，以及肝癌組織及癌旁組織MTBP和E-cadhe

6、rin蛋白的表達水平，并通過統(tǒng)計分析兩者的相關(guān)性。
　　4、通過Western blot、免疫共沉淀、激光共聚焦確定MDM2和Ub的相互作用及MTBP如何參與MDM2的泛素化從而降低E-cadherin蛋白表達影響肝癌細胞的侵襲轉(zhuǎn)移能力。
　　結(jié)果:
　　1、qRT-PCR、Western blot實驗檢測了120例肝癌組織樣本和對應的癌旁組織MTBP表達，在肝癌組織中MTBP表達明顯高于對應的癌旁組織。84(70.0

7、％)例肝癌患者中肝癌組織中MTBP高表達，而只有12個(10％)癌旁組織高于癌組織高。我們通過免疫組化染色的結(jié)果也顯示，在腫瘤組織中的MTBP蛋白的表達明顯高于對應的癌旁組織。并通過Kaplan-Meier分析發(fā)現(xiàn)MTBP高表達患者的生存率明顯低于MTBP低表達患者;
　　2、Western blot、劃痕實驗、Transwell和裸鼠成瘤等實驗方法證實在肝癌細胞中，過表達肝癌細胞中MTBP的表達，可以促進肝癌細胞的侵襲遷移能力;

8、干擾肝癌細胞中MTBP的表達，可以抑制肝癌細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移能力。
　　3、過表達肝癌細胞中MTBP的表達后E-cadherin蛋白明顯下降，干擾肝癌細胞中MTBP的表達后E-cadherin蛋白明顯升高。另外，通過Western blot實驗檢查發(fā)現(xiàn)肝癌組織及癌旁組織MTBP和E-cadherin蛋白的表達存在負相關(guān)性。
　　4、通過免疫共沉淀、激光共聚焦確定MDM2和Ub的相互作用，并證實MTBP可以通過調(diào)節(jié)MDM2的泛素