ELMO2在肝癌細(xì)胞遷移運(yùn)動(dòng)和侵襲中的功能.pdf

1、肝癌是威脅人類(lèi)健康的主要疾病之一，尤其在中國(guó)有較高的發(fā)病率，對(duì)于其研究有重要意義。腫瘤轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致惡性腫瘤患者死亡的主要原因，至今沒(méi)有找到理想的治療手段和方法。ELMOs廣泛表達(dá)于哺乳動(dòng)物細(xì)胞，主要參與細(xì)胞趨化轉(zhuǎn)移、細(xì)胞極化、凋亡和樹(shù)突發(fā)育等多項(xiàng)生命活動(dòng)。我們前期研究表明ELMOs在乳腺癌細(xì)胞的趨化運(yùn)動(dòng)中發(fā)揮著重要作用，其中ELMO1通過(guò)與Dock180形成復(fù)合物，活化Rac1和Rac2從而影響腫瘤細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)和侵襲。在本研究中，我們將EL

2、MO2與肝癌細(xì)胞趨化運(yùn)動(dòng)相關(guān)聯(lián)，分別應(yīng)用小RNA干擾技術(shù)和慢病毒技術(shù)降低及增強(qiáng)ELMO2的表達(dá)水平，從而進(jìn)一步探討ELMO2不同表達(dá)水平對(duì)肝癌細(xì)胞運(yùn)動(dòng)的影響，初步明確ELMO2在肝癌細(xì)胞趨化運(yùn)動(dòng)和轉(zhuǎn)移中的重要作用，為尋找抑制肝癌轉(zhuǎn)移的新靶點(diǎn)奠定基礎(chǔ)。
　　 方法:
　　 1.采用合成ELMO2的RNAi序列，利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染方法獲得瞬時(shí)轉(zhuǎn)染的肝癌細(xì)胞系，然后進(jìn)行Western Blotting驗(yàn)證，篩出降表達(dá)效果最明顯的序

3、列片段。
　　 2.利用篩選出降表達(dá)最有效序列合成降表達(dá)ELMO2的慢病毒質(zhì)粒，再將合成慢病毒質(zhì)粒通過(guò)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染方法制備慢病毒。
　　 3.利用生物信息學(xué)方法獲得ELMO2基因序列，合成引物制備ELMO2過(guò)表達(dá)慢病毒質(zhì)粒，利用同樣方法獲得過(guò)表達(dá)ELMO2慢病毒。
　　 4.利用制備的降表達(dá)ELMO2及過(guò)表達(dá)ELMO2慢病毒感染肝癌細(xì)胞系HepG2，經(jīng)過(guò)藥物篩選獲得穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系。
　　 5.經(jīng)Western

4、Blotting驗(yàn)證成功過(guò)表達(dá)ELMO2及降表達(dá)ELMO2的HepG2細(xì)胞系進(jìn)行相關(guān)細(xì)胞功能學(xué)實(shí)驗(yàn)，例如趨化、劃痕和侵襲以便驗(yàn)證對(duì)其趨化及遷移能力的影響。
　　 結(jié)果:
　　 1.利用合成的3個(gè)ELMO2的RNAi序列，分別轉(zhuǎn)染肝癌細(xì)胞系HepG2，經(jīng)Western Blotting驗(yàn)證篩出ELMO2-1是最有效的降表達(dá)序列。
　　 2.利用篩出ELMO2最有效降表達(dá)序列構(gòu)建慢病毒質(zhì)粒，經(jīng)過(guò)測(cè)序驗(yàn)證獲得成功，經(jīng)過(guò)

5、脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染方法包裝降表達(dá)ELMO2慢病毒。
　　 3.經(jīng)生物信息學(xué)方法獲得ELMO2基因序列，合成過(guò)表達(dá)ELMO2慢病毒質(zhì)粒獲得成功，同樣方法包裝得到過(guò)表達(dá)ELMO2慢病毒。
　　 4.利用成功制各的慢病毒感染肝癌細(xì)胞系HepG2，經(jīng)過(guò)藥物篩選獲得過(guò)表達(dá)ELMO2和降表達(dá)ELMO2的穩(wěn)轉(zhuǎn)HepG2細(xì)胞系。
　　 5.通過(guò)慢病毒感染獲得過(guò)表達(dá)ELMO2和降表達(dá)ELMO2的肝癌細(xì)胞系，同正常肝癌細(xì)胞HepG2對(duì)照組相

6、比較ELMO2蛋白表達(dá)水平明顯升高和降低。
　　 6.同對(duì)照組相比較，在劃痕實(shí)驗(yàn)中，過(guò)表達(dá)ELMO2的HepG2肝癌細(xì)胞運(yùn)動(dòng)能力增強(qiáng)，而降表達(dá)ELMO2的HepG2細(xì)胞系運(yùn)動(dòng)能力明顯降低。
　　 7.與對(duì)照組相比較，在趨化實(shí)驗(yàn)中，過(guò)表達(dá)ELMO2的細(xì)胞能夠明顯增強(qiáng)CXCL12誘導(dǎo)的肝癌細(xì)胞的趨化運(yùn)動(dòng)能力，而降表達(dá)ELMO2的HepG2細(xì)胞系趨化能力明顯降低。
　　 8.在之后的侵襲實(shí)驗(yàn)中，與對(duì)照組相比較，過(guò)表達(dá)E