ANG通過HMGA2調(diào)控肺鱗狀細胞癌細胞遷移、侵襲功能機制研究.pdf

1、目的:作為一種惡性腫瘤，肺癌在全球范圍內(nèi)的死亡率高居第一，雖然近年來針對其的診治方法已取得了長足的進展，但是其預后仍不甚理想。而降低肺癌細胞細胞的侵襲及轉(zhuǎn)移能力仍是降低肺癌發(fā)病率及致死率的重要一環(huán)。而肺鱗癌作為肺癌的第二大病理分型，占全部病理分型的40％。
　　血管生成素(ANG)作為血管核糖核酸酶RNase A家族的一員，在多種腫瘤細胞中高表達，它具有33％的氨基酸成分及56％的RNase-A同源性。ANG被認為在腫瘤血管生成的

2、過程中起著關(guān)鍵的作用。而近些年的研究發(fā)現(xiàn)，ANG可以直接刺激rRNA的轉(zhuǎn)錄從而促進細胞的增殖，并與腫瘤的預后不良具有一定的相關(guān)性。ANG還可以裂解tRNA來影響腫瘤細胞中的各種反應，包括細胞的增殖、浸潤以及細胞核中管道的形成等，而在正常的非內(nèi)皮細胞的細胞核中，ANG卻鮮有表達。
　　高遷移率族蛋白-2(HMGA2)被報道參與了多種生物學發(fā)展過程，包括胚胎的形成及腫瘤的發(fā)展。因為它可以通過改變?nèi)旧|(zhì)的結(jié)構(gòu)來調(diào)節(jié)多種靶基因的表達，HM

3、GA2常被稱為是”建筑轉(zhuǎn)錄因子”。他被報道與多種惡性腫瘤的不良預后具有相關(guān)性。
　　基于此，本研究擬探究ANG-HMGA2通路對肺鱗癌細胞增殖、遷移及侵襲能力的影響，并探討其可能的作用機制。并為今后ANG介導的相關(guān)靶向治療提供科學的依據(jù)。
　　方法:本研究分為以下三個部分:
　　1、檢測肺鱗癌組織和正常癌旁組織中ANG和HMGA的表達:收集肺鱗癌患者的腫瘤病灶組織與患者癌旁正常的肺組織，利用RT-PCR、Western

4、 Blot及免疫組織化學實驗技術(shù)在mRNA及蛋白水平檢測ANG及HMGA2在正常肺組織與肺鱗癌組織中的表達有無差異，利用免疫組織化學染色實驗對比正常癌旁肺組織標本和肺鱗癌腫瘤組織標本中ANG及HMGA2表達情況。
　　2、ANG及HMGA2在肺鱗癌細胞中表達的關(guān)聯(lián)性及對肺鱗癌細胞功能的影響:培養(yǎng)人肺鱗癌細胞株SK-MES-1，并構(gòu)建包有ANG及干擾ANG的RNA腺病毒。用Ad-ANG及ShHMGA2轉(zhuǎn)染細胞株SK-MES-1，以A

5、d-GFP及shScramble作為轉(zhuǎn)染對照，采用RT-PCR及Western Blot技術(shù)分別對比過表達及沉默ANG后HMGA2的表達差異。對比過表達及沉默HMGA2后SK-MES-1的增殖、遷移及侵襲等功能學改變。
　　3、ANG直接調(diào)控HMGA2表達的機制研究:培養(yǎng)培養(yǎng)人肺鱗癌細胞株 SK-MES-1，構(gòu)建Ad-ANG及shHMGA2，轉(zhuǎn)染SK-MES-1，以同種細胞株轉(zhuǎn)染Ad-GFP及shScramble作對照，驗證過表達

6、ANG但沉默HMGA2后兩組細胞間遷移、侵襲及增殖等功能的差異。然后采用染色體免疫共沉淀方法(CHIP)技術(shù)驗證HMGA2是否結(jié)合在ANG啟動子區(qū)。
　　結(jié)果:1、通過qPCR在12對肺鱗癌及癌旁組織對ANG和HMGA2進行mRNA層面的檢測，我們得出肺鱗癌組織中的ANG及HMGA2的mRNA表達相對于對照組明顯升高(P＜0.05)，同樣的趨勢也出現(xiàn)在Western Blot及免疫組化中。2、在細胞層面上，我們對肺鱗癌細胞系SK-

7、MES-1轉(zhuǎn)染了包有ANG的腺病毒，分別在mRNA水平及Western Blot水平驗證轉(zhuǎn)染效率后，隨后利用RT-PCR檢測實驗和對照組的ANG及HMGA2的mRNA的量，結(jié)果示，實驗組HMGA2mRNA表達水平高于對照組(P＜0.05)。而肺鱗狀細胞癌細胞系SK-MES-1中轉(zhuǎn)染Ad-ANG后行Transwell遷移及侵襲試驗后遷移及侵襲細胞數(shù)經(jīng)高倍顯微鏡計數(shù)后與對照組相比具有顯著增多（*P＜0.05）。而轉(zhuǎn)染后的細胞系在CCK8增殖

8、實驗在450nm處的OD值與對照組相比其具有顯著差異（*P＜0.05）。3、在共轉(zhuǎn)染Ad-ANG及shHMGA2后，經(jīng)PCR和Western Blot實驗檢測，HMGA2在mRNA和蛋白層面的表達相對于對照組差異明顯。Transwell遷移及侵襲試驗結(jié)果示在HMGA2干擾組中，高倍鏡下觀察，透膜遷移及侵襲的細胞明顯減少。CCK8細胞增殖試驗示HMGA2干擾組的細胞相對于對照組在OD450的吸光值明顯降低。接下來，染色體免疫共沉淀結(jié)果示A

9、NG確實與HMGA2啟動子序列有結(jié)合。
　　結(jié)論:ANG及其潛在下游調(diào)控蛋白HMGA2在肺鱗狀細胞癌組織中高表達，過表達了ANG后，HMGA2在mRNA層面及蛋白層面均顯著提高，且細胞的增殖、遷移及侵襲能力均有顯著提高。同樣過表達ANG，HMGA2抑制組細胞的增殖、遷移及增殖功能明顯降低，這進一步證實了ANG與HMGA2在肺鱗癌細胞中的關(guān)聯(lián)。最后，我們用染色體免疫共沉淀的實驗方法證實ANG是結(jié)合于HMGA2啟動子序列，表明ANG對