胃癌中HMGA2通過SOX7調(diào)控上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化和腫瘤細(xì)胞干性獲取的機(jī)制研究.pdf

1、目的：胃癌是消化道腫瘤中最常見的惡性腫瘤之一。近年來(lái)，隨著腫瘤綜合治療的開展，胃癌死亡率雖有所下降，但治療效果并無(wú)突破性進(jìn)展，在國(guó)內(nèi)其發(fā)病率和死亡率仍然位于各種惡性腫瘤的前列。目前認(rèn)為，導(dǎo)致胃癌治療失敗、預(yù)后不佳乃至患者死亡的主要原因是腫瘤的浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移，而癌細(xì)胞的侵襲和遷移是腫瘤轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。大量研究表明，上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition, EMT）與惡性腫瘤的浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，也是近年

2、來(lái)探討腫瘤轉(zhuǎn)移的研究熱點(diǎn)。EMT是多細(xì)胞生物胚胎發(fā)生發(fā)育過程中的一種常見現(xiàn)象。在EMT過程中，上皮細(xì)胞發(fā)生表型轉(zhuǎn)化，演變?yōu)轭愃瞥衫w維細(xì)胞的間質(zhì)細(xì)胞表型，主要表現(xiàn)為上皮細(xì)胞極性消失，連接上皮細(xì)胞間緊密連接相關(guān)蛋白表達(dá)降低，細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix, ECM)增多，細(xì)胞侵襲和抗凋亡能力增強(qiáng)；同時(shí)還可使腫瘤細(xì)胞獲得干細(xì)胞的特性，誘導(dǎo)腫瘤干細(xì)胞（tumor stem cells, TSCs）的發(fā)生，進(jìn)一步促進(jìn)腫瘤的侵

3、襲轉(zhuǎn)移。
　　高遷移率族蛋白A2（High mobility group protein A2，HMGA2）是一種非組蛋白染色體蛋白，作為一種結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)錄因子，其本身缺乏轉(zhuǎn)錄活性，但是可以通過改變?nèi)旧|(zhì)結(jié)構(gòu)來(lái)調(diào)節(jié)其他基因的轉(zhuǎn)錄，進(jìn)而影響胚胎形成、組織發(fā)育和腫瘤發(fā)生。HMGA2在分化成熟組織中低表達(dá)或不表達(dá)，而在胚胎發(fā)育和惡性腫瘤組織中表達(dá)明顯上調(diào)。此外， HMGA2能通過干擾細(xì)胞周期而促使上皮細(xì)胞間質(zhì)轉(zhuǎn)化及腫瘤細(xì)胞獲得干細(xì)胞特性，進(jìn)而

4、維持腫瘤細(xì)胞的分化和自我更新能力。SOX7是含HMG domain的SOX轉(zhuǎn)錄因子家族SOX F亞族的一個(gè)成員。研究發(fā)現(xiàn)， SOX7基因的 C端存在轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域，作用機(jī)制主要由于該基因是Wnt/β-catenin信號(hào)通路的負(fù)性調(diào)節(jié)因子，通過抑制Wnt/β-catenin信號(hào)通路，使細(xì)胞的異常增生活動(dòng)終止，從而發(fā)揮其腫瘤抑制的功能。
　　本課題前期研究使用染色質(zhì)共沉淀加啟動(dòng)子芯片方法（ChIP-on-chip），并通過 KEGG-

5、PATHWAY分析芯片結(jié)果，預(yù)測(cè) SOX7可能是HMGA2通過Wnt/β-catenin信號(hào)通路影響胃癌細(xì)胞發(fā)生EMT的下游靶基因。本研究旨在從胃癌組織水平、體外細(xì)胞學(xué)檢測(cè)及裸鼠移植瘤體內(nèi)驗(yàn)證等方面，探討轉(zhuǎn)錄因子HMGA2通過SOX7調(diào)控胃癌細(xì)胞發(fā)生EMT和腫瘤細(xì)胞干性獲取的機(jī)制。
　　方法：（1）采用免疫組化SP法檢測(cè)158例胃癌組織中HMGA2與Oct4的表達(dá)，分析兩者在胃癌組織中表達(dá)水平的相關(guān)性、兩者表達(dá)與臨床病理參數(shù)之間的

6、關(guān)系，以及對(duì)預(yù)后的影響；
　?。?）挑選合適的胃癌細(xì)胞株（MKN-28, SGC-7901和 MKN-45），構(gòu)建過表達(dá) HMGA2的慢病毒載體，轉(zhuǎn)染胃癌細(xì)胞 MKN-28和SGC-7901細(xì)胞，建立穩(wěn)定過表達(dá) HMGA2的胃癌細(xì)胞株，并通過western-blot驗(yàn)證干預(yù)效果；
　　（3）用免疫熒光和western-blot檢測(cè)過表達(dá)HMGA2前后胃癌細(xì)胞中干細(xì)胞標(biāo)志物CD44和Oct4的表達(dá)，并通過Transwell、

7、BrdU和Wound Healing等方法進(jìn)行過表達(dá)HMGA2前后胃癌細(xì)胞侵襲、增殖、遷移等功能學(xué)的檢測(cè)；
　?。?）通過免疫組化及 western-blot分別檢測(cè)胃癌組織中 HMGA2和 SOX7的表達(dá)，并分析二者表達(dá)的相關(guān)性；再?gòu)募?xì)胞水平檢測(cè)過表達(dá)HMGA2前后胃癌細(xì)胞中HMGA2和SOX7的表達(dá)情況；
　　（5）用生物信息學(xué)方法（UCSC軟件）分析并預(yù)測(cè)SOX7基因的啟動(dòng)子區(qū)，然后構(gòu)建 SOX7啟動(dòng)子與 HMGA2作

8、用的熒光素酶（Luciferase）報(bào)告基因，進(jìn)一步驗(yàn)證二者是否存在作用關(guān)系；
　?。?）針對(duì)SOX7基因啟動(dòng)子序列，設(shè)計(jì)合成SOX7-siRNA，用后者瞬時(shí)轉(zhuǎn)染內(nèi)源性高表達(dá) SOX7的 MKN28細(xì)胞株，并采用 qPCR和western-blot驗(yàn)證轉(zhuǎn)染效果；
　?。?）通過western-blot檢測(cè)干擾SOX7前后EMT標(biāo)志物E-cadherin, N-cadherin和Vimentin以及干細(xì)胞標(biāo)志物CD44和Oct

9、4的表達(dá)情況，并進(jìn)行相應(yīng)的細(xì)胞功能學(xué)檢測(cè)；
　　（8）通過裸鼠移植瘤模型觀察胃癌細(xì)胞在干預(yù)SOX7前后的成瘤能力、生長(zhǎng)情況和裸鼠生存時(shí)間，并通過免疫組化判斷胃癌細(xì)胞在干擾SOX7后是否在體內(nèi)也能促進(jìn)EMT和腫瘤細(xì)胞干性獲取，從而進(jìn)一步說明SOX7是否是EMT和腫瘤細(xì)胞干性獲取的調(diào)控基因。
　　結(jié)果：（1）胃癌組織中HMGA2與Oct4的表達(dá)成正相關(guān)，且二者表達(dá)與胃癌患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、血管入侵、肝轉(zhuǎn)移及臨床TNM分期有關(guān)。（2）

10、過表達(dá)HMGA2的慢病毒載體轉(zhuǎn)染內(nèi)源性低表達(dá)HMGA2的胃癌細(xì)胞株MKN28和SGC-7901后可使其遷移、侵襲能力明顯增強(qiáng)，但增殖能力降低；干細(xì)胞標(biāo)志物CD44和Oct4表達(dá)明顯升高。
　?。?）胃癌組織中HMGA2與SOX7的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)；SOX7啟動(dòng)子熒光素酶（Luciferase）報(bào)告基因發(fā)現(xiàn)HMGA2與其下游的SOX7存在作用關(guān)系，HMGA2過表達(dá)后可以明顯降低SOX7啟動(dòng)子活性。
　?。?） SOX7-siRNA

11、干擾內(nèi)源性高表達(dá)SOX7的MKN28細(xì)胞后， E-cadherin表達(dá)降低，N-cadherin、Vimentin、CD44及Oct4表達(dá)升高；同時(shí)細(xì)胞侵襲遷移能力增強(qiáng)，增值能力抑制；裸鼠移植瘤實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，使用SOX7-SiRNA干擾的MKN28細(xì)胞成瘤能力更強(qiáng)，但是移植瘤的生長(zhǎng)速度減慢。
　　結(jié)論：HMGA2和Oct4在胃癌組織中高表達(dá)，且與腫瘤的浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移及患者的預(yù)后有關(guān)；穩(wěn)定過表達(dá)HMGA2及用SOX7-siRNA干擾胃癌細(xì)胞都