USP22通過Wnt-β-catenin信號通路調(diào)節(jié)胰腺導(dǎo)管腺癌中FoxM1表達(dá)以及對上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的調(diào)控機(jī)制研究.pdf

1、目的：90％以上的胰腺惡性腫瘤為起源于腺管上皮的胰腺導(dǎo)管腺癌(pancreatic ductaladenocarcinoma，PDA)，其惡性程度高，預(yù)后極差，早期即可發(fā)生淋巴道、大血管及遠(yuǎn)處器官轉(zhuǎn)移，確診時多數(shù)患者已達(dá)中晚期，喪失了最佳的手術(shù)治療時機(jī)。至今仍缺乏可靠的早期診斷標(biāo)志物和有效的治療方法。
　　USP22(ubiquitin-specific protease22)是一種泛素特異肽酶，屬于去泛素化酶DUBs家族，是hS

2、AGA復(fù)合物的一個亞單位，參與細(xì)胞周期的調(diào)控，并能夠激活BMI-1、MYC、FBP1等介導(dǎo)的靶基因轉(zhuǎn)錄，在細(xì)胞周期調(diào)控、胚胎發(fā)育及端粒動態(tài)平衡等過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用，被認(rèn)為是腫瘤干細(xì)胞的標(biāo)志物之一。目前已發(fā)現(xiàn)USP22的異常高表達(dá)與多種實體瘤的轉(zhuǎn)移潛能、和預(yù)后密切相關(guān)，但且其與胰腺導(dǎo)管腺癌的關(guān)系尚未見報道。
　　惡性腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致患者治療失敗、預(yù)后不佳甚至死亡的最主要因素。最近的研究表明，上皮細(xì)胞-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epitheli

3、al-mesenchymal transition，EMT）與胰腺導(dǎo)管腺癌的侵襲轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。EMT的發(fā)生使腫瘤細(xì)胞獲得了向周圍組織浸潤和侵入鄰近脈管系統(tǒng)的能力，并最終轉(zhuǎn)移到其他的組織或器官形成轉(zhuǎn)移灶。同時，通過對大樣本的胰腺癌病理組織切片進(jìn)行免疫組化分析發(fā)現(xiàn)，EMT的發(fā)生與胰腺癌的不良預(yù)后顯著相關(guān)。但目前關(guān)于USP22的研究多集中在其調(diào)控細(xì)胞周期的作用上，而USP22異常表達(dá)促進(jìn)腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移的潛在機(jī)制尚未見報道。
　　本文旨在揭

4、示USP22與胰腺導(dǎo)管腺癌臨床預(yù)后的相關(guān)性，并初步闡明其在胰腺導(dǎo)管腺癌發(fā)生發(fā)展中的機(jī)制，為胰腺癌的早期診斷及靶向治療提供新的思路。
　　方法：
　　1、收集2002至2013年在大連醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院及大連醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院病理科存檔石蠟組標(biāo)本且臨床資料完整的胰腺導(dǎo)管腺癌患者136例及癌旁正常組織42例。采用免疫組化法測定所有病理標(biāo)本中USP22、FoxM1的表達(dá)情況，并對所有病例進(jìn)行隨訪。分析USP22、FoxM1以及

5、USP22/FoxM1共表達(dá)與PDA患者臨床病理特征和預(yù)后的相關(guān)性。應(yīng)用SPSS17.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，以P＜0.05為顯著性標(biāo)準(zhǔn)。表達(dá)率的組間差異比較采用x2檢驗;預(yù)后的單因素分析采用Kaplan-Meier曲線，組間比較采用Log-Rank檢驗;預(yù)后的多因素分析采用COX回歸風(fēng)險模型。
　　2、利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將重組的USP22過表達(dá)質(zhì)?；騏SP22干擾質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至人胰腺導(dǎo)管腺癌細(xì)胞系（PANC-1/CFPAC-1）中。并

6、通過G418篩選穩(wěn)定轉(zhuǎn)染USP22干擾或過表達(dá)質(zhì)粒的PANC-1細(xì)胞克隆。
　　3、采用RT-PCR法檢測USP22、FoxM1的基因表達(dá)。
　　4、采用Western blot檢測USP22、FoxM1、Wnt通路相關(guān)蛋白以及EMT標(biāo)志蛋白的表達(dá)。
　　5、采用間接免疫熒光方法檢測USP22、FoxM1、β-catenin、F-actin、E-Cadherin以及Ezrin的表達(dá)。
　　6、利用劃痕及trans

7、well實驗觀察和分析PANC-1細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移能力。
　　結(jié)果：
　?。ㄒ唬︰SP22、FoxM1在胰腺導(dǎo)管腺癌中的表達(dá)及預(yù)后相關(guān)性研究
　　1、PDA組織中USP22和FoxM1的表達(dá)顯著高于癌旁正常組織(P＜0.001)，且USP22與FoxM1的表達(dá)呈明顯的正相關(guān)(r=0.450，P＜0.001)。
　　2、配對的5例新鮮癌組織中USP22、FoxM1的表達(dá)均明顯高于癌旁正常組織。同時，低分化的PANC-

8、1細(xì)胞系中USP22、FoxM1的表達(dá)明顯高于高分化的CFPAC-1細(xì)胞系。
　　3、USP22的表達(dá)與PDA患者的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(P=0.009)和TNM分期(P=0.031)顯著相關(guān);FoxM1表達(dá)與PDA患者的組織分化(P=0.020)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(P=0.015)和TNM分期(P=0.018)顯著相關(guān)。同時，USP22/FoxM1共表達(dá)陽性與PDA患者的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(P=0.011)和TNM分期(P=0.041)顯著相關(guān)。

9、>　　4、Kaplan-Meier分析顯示，PDA患者中USP22、FoxM1陽性或USP22/FoxM1共表達(dá)陽性患者的OS較陰性患者明顯縮短(log-rank P=0.033; log-rank P＜0.001;log-rank P＜0.001)（見圖2）。
　　5、單因素生存分析顯示，USP22(HR:1.944;95％ CI:0.895-2.996; P=0.034)、FoxM1(HR:1.823;95％ CI:1.369

10、-3.881; P＜0.001)、USP22/FoxM1共表達(dá)(HR:2.895;95％ CI:1.346-4.237; P＜0.001)、組織分化、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及TNM分期與PDA患者的預(yù)后具有顯著的相關(guān)性。
　　6、模型A的多因素生存分析顯示，USP22(adjusted HR:1.675;95％ CI:1.008-2.146; P=0.027)、FoxM1(adjusted HR:1.732;95％ CI:1.262-2.94

11、7; P=0.032)和TNM分期可以作為PDA患者的獨立預(yù)后因素。
　　7、模型B的多因素生存分析顯示，USP22/FoxM1共表達(dá)(adjusted HR:1.328;95％ CI:1.175-1.923; P=0.029)和TNM分期可以作為PDA患者的獨立預(yù)后因素。
　?。ǘ︰SP22通過促進(jìn)β-catenin核內(nèi)移上調(diào)胰腺導(dǎo)管腺癌細(xì)胞中Wnt/β-catenin信號通路活性和FoxM1表達(dá)并誘導(dǎo)G1/S期轉(zhuǎn)變的機(jī)

12、制研究
　　1、在PANC-1中干擾USP22的表達(dá)會導(dǎo)致Wnt/β-catenin信號通路活性下降，標(biāo)志蛋白Axin2、LEF-1以及下游靶蛋白C-Myc的表達(dá)下調(diào)。在CFPAC-1中上調(diào)USP22的表達(dá)會導(dǎo)致Wnt/β-catenin信號通路活性下降，標(biāo)志蛋白Axin2、LEF-1以及下游靶蛋白c-Myc的表達(dá)下調(diào)。
　　2、PANC-1中伴隨著USP22的梯度下降，細(xì)胞核內(nèi)β-catenin的表達(dá)梯度下降而細(xì)胞漿中β-

13、catenin的表達(dá)梯度上升，同時細(xì)胞核和細(xì)胞漿中FoxM1的表達(dá)均呈梯度下降;CFPAC-1中伴隨著USP22的梯度上調(diào)，細(xì)胞核內(nèi)β-catenin的表達(dá)梯度上調(diào)而細(xì)胞漿中β-catenin的表達(dá)梯度下降，同時細(xì)胞核和細(xì)胞漿中FoxM1的表達(dá)均呈梯度上調(diào)。另外，PANC-1細(xì)胞系中通過β-catenin過表達(dá)質(zhì)粒上調(diào)β-catenin的表達(dá)后，即使利用USP22-siRNA下調(diào)USP22的表達(dá)，細(xì)胞核及細(xì)胞漿中FoxM1的表達(dá)也未發(fā)生

14、明顯變化，同時CFPAC-1中我們利用β-catenin-siRNA干擾β-catenin的表達(dá)后即使過表達(dá)USP22，細(xì)胞核及細(xì)胞漿中FoxM1的表達(dá)也均未發(fā)生明顯變化。
　　3、我們通過在PANC-1和CFPAC-1兩個細(xì)胞系中過表達(dá)USP22或干擾FoxM1，發(fā)現(xiàn)USP22過表達(dá)后兩種細(xì)胞的增殖都受到明顯促進(jìn)，而干擾FoxM1后兩細(xì)胞系的增值均受到明顯抑制。我們進(jìn)一步的實驗發(fā)現(xiàn)當(dāng)在兩個細(xì)胞系中干擾FoxM1的表達(dá)后，即使過表

15、達(dá)USP22，兩細(xì)胞系的細(xì)胞增殖均未見明顯變化。另外，采用流式細(xì)胞技術(shù)檢測發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)USP22后，細(xì)胞周期中G1/S期轉(zhuǎn)變加快，G1期所占比例下降明顯，S期和G2/M期比例上升;干擾FoxM1后，細(xì)胞發(fā)生明顯的G0/G1期阻滯。但當(dāng)我們干擾FoxM1的表達(dá)后，即使過表達(dá)USP22，兩細(xì)胞系的細(xì)胞周期均未見明顯改變。
　　4、過表達(dá)USP22后，兩個細(xì)胞系中p21和p27有明顯下調(diào)，并伴隨著CyclinD1、Cdk4和Cdk6表達(dá)

16、的上升;干擾FoxM1的表達(dá)后，，兩個細(xì)胞系中p21和p27有明顯上調(diào)，并伴隨著CyclinD1、Cdk4和Cdk6表達(dá)的下降，但當(dāng)我們在干擾FoxM1的表達(dá)同時過表達(dá)USP22，兩細(xì)胞系G1期細(xì)胞周期相關(guān)蛋白的表達(dá)并未現(xiàn)顯著變化。
　　（三）USP22通過FAK信號通路促進(jìn)Ezrin介導(dǎo)的細(xì)胞骨架重構(gòu)和上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化并誘導(dǎo)胰腺癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移的機(jī)制研究
　　1、我們首先通過激光共聚焦-免疫熒光試驗檢測了Panc-usp及Pa

17、nc-uspsh中F-actin的表達(dá)發(fā)現(xiàn)，Panc-usp中出現(xiàn)大量縱向排列的細(xì)胞質(zhì)肌動蛋白纖維。而在Panc-uspsh中，actin的表達(dá)呈現(xiàn)點狀，細(xì)胞質(zhì)肌動蛋白纖維消失。之后我們檢測了作為細(xì)胞膜分子和細(xì)胞骨架之間的重要調(diào)節(jié)蛋白和連接蛋白的Ezrin蛋白的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)Panc-uspsh中Ezrin的表達(dá)主要集中在細(xì)胞質(zhì)。有趣的是在USP22穩(wěn)定過表達(dá)的Panc-usp細(xì)胞中，Ezrin的表達(dá)明顯向細(xì)胞膜靠攏，細(xì)胞質(zhì)中幾乎消失。之后

18、的Western blot結(jié)果發(fā)現(xiàn)，雖然在PANC-1、Panc-uspsh以及Panc-usp中Ezrin的表達(dá)并沒有發(fā)生明顯變化，但是Ezrin的磷酸化水平發(fā)生了明顯改變。Panc-usp中P-Ezrin的表達(dá)6.4倍于Panc-uspsh中的表達(dá)。
　　2、我們在Panc-usp中分別轉(zhuǎn)染了control-siRNA及FAK-siRNA，結(jié)果發(fā)現(xiàn)隨著FAK表達(dá)的下降，P-FAK的表達(dá)也相應(yīng)下降，同時，P-Ezrin的表達(dá)也明

19、顯下調(diào)。與此同時，我們在Panc-uspsh中分別轉(zhuǎn)染了空白質(zhì)粒及FAK過表達(dá)質(zhì)粒，發(fā)現(xiàn)隨著FAK表達(dá)的上調(diào)，P-FAK的表達(dá)也隨之上升，同時，P-Ezrin的表達(dá)也明顯升高。
　　3、Western blot的結(jié)果顯示Panc-usp細(xì)胞中間充質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物N-鈣粘蛋白、波形蛋白及纖維連接蛋白的表達(dá)較Panc-uspsh分別增加5.8、4.2、2.7倍，而上皮細(xì)胞分子標(biāo)志E-鈣粘蛋白在Panc-usp中表達(dá)比Panc-uspsh中

20、表達(dá)減少了75.3％。對EMT相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的檢測發(fā)現(xiàn)，Pancnnn-usp中ZEB1和Snail的表達(dá)分別5.6倍和5.3倍于Panc-uspsh中的表達(dá)。
　　4、在Panc-usp細(xì)胞轉(zhuǎn)染FAK-siRNA后，隨著P-FAK的下調(diào)，間充質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物N-鈣粘蛋白、波形蛋白及纖維連接蛋白的表達(dá)也分別下降了63.8％、81.3％、64.5％，而上皮細(xì)胞標(biāo)志物E-鈣粘蛋白的表達(dá)增加了4.2倍。EMT相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子ZEB1和Snail

21、的表達(dá)也隨著P-FAK的下調(diào)而分別下降了為86.2％和78.4％。而在Panc-uspsh細(xì)胞轉(zhuǎn)染FAK過表達(dá)質(zhì)粒后，隨著P-FAK的上調(diào)，間充質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物N-鈣粘蛋白、波形蛋白及纖維連接蛋白的表達(dá)分別增加了5.2、1.4、3.6倍，而上皮細(xì)胞標(biāo)志物E-鈣粘蛋白的表達(dá)下降87.5％。EMT相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子ZEB1和Snail的表達(dá)也隨著P-FAK的上調(diào)分別增加了2.8倍和3.6倍。
　　5、劃痕及transwell試驗發(fā)現(xiàn)，Panc

22、-usp細(xì)胞的遷移及侵襲能力明顯高于Panc-uspsh細(xì)胞，同時，Panc-usp中下調(diào)FAK的表達(dá)能夠明顯下調(diào)其遷移及侵襲率而Panc-uspsh中過表達(dá)FAK能夠顯著上調(diào)其遷移及侵襲率。
　　結(jié)論：
　　（一）USP22、FoxM1在胰腺導(dǎo)管腺癌中的表達(dá)及預(yù)后相關(guān)性研究
　　1、USP22、FoxM1在PDA中的表達(dá)顯著高于正常組織，且兩者的表達(dá)呈正相關(guān)，表明二者可能起協(xié)同作用參與了PDA的發(fā)生發(fā)展過程。

23、　　2、USP22表達(dá)與PDA患者的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和臨床分期相關(guān)，F(xiàn)oxM1與組織分化、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和臨床分期相關(guān)，USP22/ FoxM1共表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和臨床分期密切相關(guān)，表明二者在PDA的侵襲轉(zhuǎn)移中發(fā)揮作用。
　　3、USP22、FoxM1、USP22/FoxM1共表達(dá)均與PDA患者的臨床預(yù)后密切相關(guān)，且可作為PDA的獨立預(yù)后因子。
　?。ǘ︰SP22通過促進(jìn)β-catenin核內(nèi)移上調(diào)胰腺導(dǎo)管腺癌細(xì)胞中Wnt/β-ca

24、tenin信號通路活性和FoxM1表達(dá)并誘導(dǎo)G1/S期轉(zhuǎn)變的機(jī)制研究
　　1、胰腺癌細(xì)胞系中USP22的表達(dá)可影響Wnt/β-catenin通路活性。
　　2、胰腺癌細(xì)胞系中USP22通過促進(jìn)β-catenin核內(nèi)移上調(diào)FoxM1的表達(dá)。
　　3、胰腺癌細(xì)胞系中USP22可通過上調(diào)FoxM1表達(dá)促進(jìn)G1/S期轉(zhuǎn)變和細(xì)胞增殖。
　　4、胰腺癌細(xì)胞系中USP22通過上調(diào)FoxM1影響G1期細(xì)胞周期調(diào)控蛋白的表達(dá)。

25、r>　　（三）USP22通過FAK信號通路促進(jìn)Ezrin介導(dǎo)的細(xì)胞骨架重構(gòu)和上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化并誘導(dǎo)胰腺癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移的機(jī)制研究
　　1、PANC-1細(xì)胞系中Ezrin蛋白重分布及磷酸化在USP22導(dǎo)致的細(xì)胞骨架重構(gòu)中起重要作用。
　　2、PANC-1細(xì)胞系中過表達(dá)USP22可促進(jìn)細(xì)胞由上皮細(xì)胞表型向間充質(zhì)細(xì)胞表型轉(zhuǎn)變。
　　3、PANC-1細(xì)胞系中過表達(dá)USP22能夠促進(jìn)PANC-1細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。
　　4、PA