SOX3通過Wnt-β-catenin信號通路促進食管鱗癌發(fā)生發(fā)展的機制研究.pdf

1、在全世界最常見的惡性腫瘤中，食管癌(esophageal carcinoma，EC)的發(fā)病率居第8位，死亡率居第6位。2008年，全球約有482，300人罹患EC，406，800人死于EC。由于大部分EC病人就診時已屬于局部晚期或已發(fā)生遠處轉(zhuǎn)移，因此EC病人的5年生存率僅為19％。EC分為兩種主要的病理類型，即食管鱗癌(esophageal squamouscell carcinoma，ESCC)和食管腺癌(esophageal ade

2、nocarcinoma，EAC)，兩者的地理分布和好發(fā)部位有著顯著差異:腺癌常見于西方國家，好發(fā)于下段食管和胃食管交界部;而ESCC常見于亞洲國家，尤其是中國和伊朗，多見于中、上段食管。中國是EC高發(fā)地區(qū)，占全球EC總數(shù)的一半以上(2008年約有259，235例新發(fā)病例)，其中90％以上是ESCC。早期診斷是提高ESCC病人預(yù)后的關(guān)鍵，但由于缺乏有效的特異性腫瘤標志物和預(yù)后因子，目前尚難以對ESCC進行早期診斷和預(yù)后評估。
　　S

3、OX(Sry-like HMG box)蛋白家族屬于HMGb(high-mobility group box)蛋白超家族，是一種DNA結(jié)合蛋白。SOX在不同的物種間高度保守，參與多種生理發(fā)育過程，包括:神經(jīng)發(fā)生、軟骨形成和睪丸發(fā)育等。人SOX3是SOXB1亞組中的一員，定位于染色體Xq27.1，是一種轉(zhuǎn)錄因子。在發(fā)育過程中SOX3表達逐漸降低，使細胞由增殖型轉(zhuǎn)變?yōu)榉只?。在體外實驗中，SOX3外源性表達增高可誘導雞胚成纖維細胞向腫瘤細胞

4、轉(zhuǎn)化。此外，已證實SOX3是一種原癌基因，其含有逆轉(zhuǎn)錄病毒插入位點，與逆轉(zhuǎn)錄病毒DNA結(jié)合后，可導致淋巴瘤。近期的研究表明，小細胞肺癌病人的血清中SOX3自身抗體濃度明顯增高。以上結(jié)果提示SOX3可能與腫瘤發(fā)生、發(fā)展有關(guān)。
　　Wnt/β-catenin信號轉(zhuǎn)導通路是目前公認的腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中的重要機制。在穩(wěn)定狀態(tài)下，當Wnt信號缺失時，胞漿內(nèi)的β-catenin被糖原合成酶激酶(glycogen synthasekinase3

5、β，GSK3β)磷酸化，使β-catenin發(fā)生降解，并維持其在胞漿內(nèi)的低濃度。Wnt/β-catenin通路激活的具體過程為:1.由細胞分泌的Wnt蛋白同時與細胞表面的Fzd跨膜受體和共受體LRP5/6結(jié)合，共同形成Wnt受體復合物，這是Wnt信號通路激活的重要起始步驟。2.在胞漿內(nèi)，Wnt受體復合物抑制GSK3β/APC/Axin/CK1α復合物中的關(guān)鍵成分GSK3β的活性，阻止GSK3β對β-catenin的磷酸化作用，使β-ca

6、tenin的降解減少，導致β-catenin在胞漿內(nèi)逐漸聚積。3.當胞漿中β-catenin達到一定濃度時就向胞核內(nèi)轉(zhuǎn)運，轉(zhuǎn)入胞核后，β-catenin與核內(nèi)的轉(zhuǎn)錄因子TCF/LEF相互作用，調(diào)節(jié)靶基因cyclinDl、c-myc和c-jun等的表達，從而發(fā)生促癌作用。目前已在多種人類腫瘤中發(fā)現(xiàn)β-catenin發(fā)生突變或調(diào)控障礙，如結(jié)直腸癌、腎癌、乳腺癌、胰腺癌、肝細胞癌等。近期的研究發(fā)現(xiàn)，Wnt/β-catenin途徑還可能與腫瘤干

7、細胞性的維持以及腫瘤耐藥有著密切的關(guān)系。
　　目前對SOX3在ESCC中的研究鮮有報道，對SOX3在ESCC中的作用機制尚不清楚。有必要進一步明確SOX3表達與ESCC病人臨床病理特征及預(yù)后的關(guān)系，深入研究SOX3表達改變對ESCC細胞生物學行為的影響及其與Wnt/β-catenin信號通路的相互作用關(guān)系，并探索SOX3在ESCC發(fā)生、發(fā)展中的作用和機制。
　　目的:
　　本研究首次以ESCC組織和細胞作為研究對象，觀

8、察SOX3表達改變與ESCC病人臨床病理特征和預(yù)后的關(guān)系，以及對ESCC細胞生物學行為的影響，明確ESCC中SOX3與Wnt/β-catenin信號通路的相互作用關(guān)系。初步揭示SOX3在ESCC發(fā)生發(fā)展過程中的作用和機制，為ESCC的早期診斷和預(yù)后評估提供依據(jù)。
　　方法:
　　1.收集臨床病理資料和組織學標本，采用RT-PCR、Western blot和免疫組織化學實驗，檢測SOX3在ESCC及其對應(yīng)遠癌非腫瘤食管黏膜上皮

9、(non-neoplastic esophagealepithelium，NE)組織中的表達，分析SOX3表達與ESCC病人臨床病理特征之間的關(guān)系。并對ESCC術(shù)后病人進行隨訪，進一步研究SOX3表達與ESCC病人預(yù)后的關(guān)系。
　　2.篩選出SOX3高表達的ESCC細胞株，并構(gòu)建SOX3 siRNA表達質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染SOX3高表達的ESCC細胞，建立穩(wěn)定抑制SOX3表達ESCC細胞株。通過MTT細胞增殖實驗、劃痕愈合實驗、Transw

10、ell小室侵襲實驗和流式細胞術(shù)凋亡檢測等體外實驗觀察SOX3表達抑制對ESCC細胞增殖、遷移、侵襲和凋亡功能的影響。
　　3.采用Western blot檢測SOX3抑制后ESCC細胞Wnt/β-catenin信號通路關(guān)鍵因子p-GSK3βser9、β-catenin、TCF4、c-myc和cyclin D1蛋白的表達，并使用Wnt/β-catenin信號通路激活劑LiCl處理ESCC細胞，采用MTT細胞增殖實驗、細胞劃痕實驗和T

11、ranswell小室侵襲實驗觀察SOX3通過Wnt/β-catenin信號通路對ESCC細胞的增殖、遷移和侵襲能力的調(diào)控作用。
　　結(jié)果:
　　1.RT-PCR、Western blot和免疫組化實驗表明，SOX3 mRNA和蛋白在ESCC組織中的表達明顯高于其在對應(yīng)遠癌NE組織中的表達。
　　2.免疫組化實驗表明，SOX3表達增高與腫瘤區(qū)域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（N分期）和TNM分期進展顯著相關(guān)。SOX3表達增高的ESCC病人的

12、無病生存率(recurrence-free survival，RFS)和總體生存率(overall survival，OS)均明顯降低，且是ESCC病人的獨立預(yù)后因子。
　　3.成功篩選出SOX3高表達的ESCC細胞株(TE-10細胞)。構(gòu)建了SOX3 siRNA表達質(zhì)粒并轉(zhuǎn)染TE-10細胞，成功建立了穩(wěn)定抑制SOX3的ESCC細胞株(siSOX3TE-10細胞株)。
　　4.MTT細胞增殖實驗、劃痕愈合實驗、Transwe

13、ll小室侵襲實驗和流式細胞術(shù)凋亡檢測表明，SOX3表達降低對ESCC細胞增殖、遷移和侵襲能力起抑制作用，而對ESCC細胞凋亡起促進作用。
　　5.Western blot實驗表明，SOX3抑制后Wnt/β-catenin信號通路關(guān)鍵因子p-GSK3βser9、β-catenin、TCF4、c-myc和cyclin D1蛋白表達降低。使用Wnt/β-catenin信號通路激活劑LiCl處理ESCC細胞，采用MTT細胞增殖實驗、細胞劃

14、痕愈合實驗和Transwell小室侵襲實驗證明，SOX3可通過Wnt/β-catenin信號通路促進ESCC細胞的增殖、遷移和侵襲。
　　結(jié)論:
　　1.SOX3在ESCC中表達增高。
　　2.SOX3表達增高與ESCC區(qū)域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（N分期）和TNM分期進展有關(guān)。SOX3表達增高的ESCC病人的RFS和OS均明顯降低，且是ESCC病人的獨立預(yù)后因子。
　　3.SOX3通過調(diào)節(jié)Wnt/β-catenin信號通路對