WNT-β-catenin信號通路在不同癌癥發(fā)生中的作用研究.pdf

1、研究背景:
　　WNT/β-catenin信號通路在人類器官和腫瘤發(fā)生中發(fā)揮關(guān)鍵效應(yīng)。WNTs是一組能夠編碼分泌型富含半胱氨酸的糖蛋白，其作為信號分子用于調(diào)節(jié)不同階段的胚胎發(fā)育并參與維持組織穩(wěn)態(tài)。WNT信號的畸變或異常將導(dǎo)致多種人類疾病，如白血病，先天性四肢切斷癥，精神分裂癥，腎損傷，骨發(fā)病率，肺纖維化和不同種類的癌癥。依據(jù)是否涉及β-catenin，WNT信號通路可分為典型（WNT/β-catenin途徑）和非典型途徑(WNT/

2、平面細胞極性(PCP)或WNT/Ca2+途徑）。目前，最廣泛研究的WNT途徑是典型WNT/β-catenin途徑，其在癌癥起始和進展中發(fā)揮的作用。在WNT/β-catenin途徑中，WNT配體可以結(jié)合卷曲蛋白（frizzled，F(xiàn)rz）受體激活蓬亂蛋白(DSH)，β-catenin磷酸化被抑制，導(dǎo)致細胞內(nèi)β-catenin積累和核易位，隨后β-catenin作為轉(zhuǎn)錄共激活因子與T細胞因子(TCF)/淋巴增強因子(LEF1)轉(zhuǎn)錄因子復(fù)合，

3、并激活下游靶基因使之過表達，如Cyclin D1，c-MYC，PLA2G2A等。TCF/LEF家族是一組通過高遷移率基團結(jié)合DNA的轉(zhuǎn)錄因子。WNT/β-catenin信號通路激活后，其核心參與者β-catenin從細胞質(zhì)轉(zhuǎn)移到細胞核，并結(jié)合到TCF/LEF家族的成員，可以將共激活因子β-catenin募集到它們所靶向基因的增強子元件中，LEF1和TCF是WNT/β-catenin信號通路的轉(zhuǎn)錄中樞調(diào)節(jié)劑。到目前為止，接近50％的人類已

4、知腫瘤顯示都與WNT/β-catenin信號傳導(dǎo)通路的調(diào)節(jié)異常有關(guān)。
　　甲狀腺癌(TC)是最常見的內(nèi)分泌器官的惡性腫瘤，大多數(shù)國家的死亡率為男性0.2～0.4/100，000，女性0.2～0.6/100，000。乳頭狀甲狀腺癌(PTC)是TC最常見的腫瘤亞型，至少占TC的70～80％。由于診斷技術(shù)的提高，大多數(shù)國家在過去幾十年中TC（主要是PTC）的發(fā)病率呈上升勢頭。2014年，在美國大約有63000例新發(fā)的TC被確診。從197

5、5年到2009年，每年的TC發(fā)病率從每100，000人4.9增加到每100，000人14.3，PTC的發(fā)病率從每100，000人3.4增加到每100，000人12.5。因此PTC發(fā)病率的迅速增加在這一變化中發(fā)揮重要的推動作用。到2019年，研究預(yù)測PTC發(fā)病率將增加一倍。這既會給身體健康帶來嚴重影響，又會給家庭、社會和國家?guī)砹她嫶蟮慕?jīng)濟負擔(dān)。
　　胃癌(GC)是一種常見的惡性腫瘤，大約占全球侵襲性腫瘤的10％。在中國，GC的致死

6、率占癌癥死亡原因的第二位。盡管有報告提出進展期胃癌(AGC)的5年總體生存率在15％～52％之間而早期胃癌(EGC)的5年總體生存率在88％～97％之間，早期發(fā)現(xiàn)、檢測和治療可以顯著降低死亡率。目前，大范圍的人口變化和環(huán)境污染日益加重伴隨GC確診病例和死亡的數(shù)量大量增加。研究已證實GC發(fā)病率與環(huán)境污染呈正相關(guān)性。
　　研究方法與結(jié)果:
　　本文旨在研究WNT/β-catenin信號通路在PTC和GC發(fā)生中的作用，主要包括以下

7、研究內(nèi)容:
　　1.WNT/β-catenin信號通路在PTC發(fā)生中的作用。
　　1.1運用人類全基因組寡核苷酸微陣列芯片V2.0來比較5組PTC組織和鄰近正常組織。
　　研究方法:為了研究和探索參與PTC發(fā)生的分子機制，運用人類全基因組寡核苷酸微陣列芯片V2.0來比較5組PTC組織與鄰近正常組織，篩選出1.5倍上調(diào)或下調(diào)基因表達。運用QRT-PCR和Western blot進一步驗證WNT10A，CCND1，RXRG

8、，LEF1，MYC，CTNNB1，TPM3在PTC與鄰近正常組織的mRNA和蛋白水平的表達差異。
　　研究結(jié)果:使用DAVID分析，六個基因(CCND1，RXRG，LEF1，MYC，CTNNB1，TPM3，WNT10A)被發(fā)現(xiàn)上調(diào)超過1.5倍在PTC中。WNT10A是WNT配體中唯一表達上調(diào)超過1.5倍并其表達上調(diào)超出4倍。QRT-PCR和Western blot分別驗證WNT10A，CCND1，RXRG，LEF1，MYC，CTN

9、NB1，TPM3在PTC組織中表達上調(diào)，與DNA微陣列芯片結(jié)果完全吻合。WNT10A/β-catenin信號通路在PTC中被激活。
　　1.2 WNT10A/β-catenin信號通路的激活對PTC細胞增殖的影響。
　　研究方法:給予PTC細胞(K1)不用濃度WNT10A過表達質(zhì)粒，通過CCK8細胞增殖實驗檢測不用濃度WNT10A過表達質(zhì)粒與細胞增殖能力之間是否存在劑量效應(yīng);隨后給予K1細胞WNT10A過表達質(zhì)粒、干擾RNA

10、WNT10A、LEF1過表達質(zhì)粒、干擾RNALEF1轉(zhuǎn)染，通過CCK8細胞增殖實驗、QRT-PCR和Western blot檢測并明確WNT10A/β-catenin信號通路對K1細胞增殖的影響。
　　研究結(jié)果:CCK8實驗結(jié)果回示W(wǎng)NT10A/β-catenin信號通路對K1細胞增殖作用隨WNT10A質(zhì)粒濃度增加而增強，存在劑量效應(yīng)依賴。隨后實驗過程中，分別給予K1細胞WNT10A過表達質(zhì)粒、WNT10A過表達質(zhì)粒+干擾RNAL

11、EF1、LEF1過表達質(zhì)粒、LEF1過表達質(zhì)粒+干擾RNAWNT10A轉(zhuǎn)染，CCK8結(jié)果顯示:WNT10A過表達質(zhì)粒與LEF1過表達質(zhì)粒對K1細胞增殖能力有顯著增強效應(yīng)，干擾RNALEF1與干擾RNAWNT10A加入后其增殖能力下降。其次QRT-PCR和Western blot結(jié)果顯示:WNT10A過表達質(zhì)粒與LEF1過表達質(zhì)粒作用于K1細胞時，WNT10A，CCND1，LEF1，MYC，CTNNB1在mRNA與蛋白水平表達明顯上調(diào);加

12、入干擾RNA LEF1與干擾RNAWNT10A作用于K1細胞時，WNT10A，CCND1，LEF1，MYC，CTNNB1在mRNA與蛋白水平表達明顯下降。
　　1.3 WNT10A/β-catenin信號通路的激活對PTC細胞晚期凋亡的影響。
　　研究方法:通過流式細胞儀分別測定K1細胞周期與細胞凋亡，K1細胞分別給予WNT10A過表達質(zhì)粒、WNT10A過表達質(zhì)粒+干擾RNALEF1、LEF1過表達質(zhì)粒、LEF1過表達質(zhì)粒+

13、干擾RNAWNT10A轉(zhuǎn)染。
　　研究結(jié)果:細胞凋亡與WNT10A和LEF1有密切相關(guān)性。結(jié)果表明WNT10A過表達質(zhì)粒與LEF1過表達質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染于K1細胞都會引起晚期凋亡細胞的比例下降;干擾RNALEF1和干擾RNAWNT10A轉(zhuǎn)染于K1細胞則引起晚期凋亡細胞比例升高。細胞周期檢測結(jié)果回示:干擾RNAWNT10A轉(zhuǎn)染K1細胞后導(dǎo)致大量細胞靜息于細胞周期S期。
　　1.4激活WNT10A/β-catenin信號通路對PTC

14、細胞遷移能力的影響。
　　研究方法:通過傷口愈合實驗分別監(jiān)測給予WNT10A過表達質(zhì)粒、WNT10A過表達質(zhì)粒+干擾RNALEF1、LEF1過表達質(zhì)粒、LEF1過表達質(zhì)粒+干擾RNAWNT10A轉(zhuǎn)染后K1細胞的遷移能力如何變化。
　　研究結(jié)果:在0h～72h之內(nèi)，WNT10A過表達質(zhì)粒與LEF1過表達質(zhì)粒增強K1細胞遷移能力，加入干擾RNA抑制K1細胞遷移能力。
　　2.WNT/β-catenin信號通路在PFDA誘導(dǎo)

15、胃癌細胞增殖中的作用
　　2.1運用DNA微陣列芯片比較PFDA實驗組人胃癌AGS細胞與對照DMSO組人胃癌AGS細胞的差異。
　　研究方法:為研究PFDA調(diào)節(jié)胃癌細胞增殖的新的分子機制，運用DNA微陣列芯片比較PFDA處理后人胃癌AGS細胞與對照DMSO處理后人胃癌AGS細胞。利用QRT-PCR和Western blot驗證PFDA處理組與DMSO對照組在mRNA與蛋白水平表達的差別，是否與DNA微陣列芯片結(jié)果一致。

16、>　　研究結(jié)果:在DAVID分析中，sPLA2-ⅡA(PLA2G2A)其表達是對照中的21.4％，并且在所有分析基因排第三個改變;sPLA2-ⅡA上游轉(zhuǎn)錄因子TCF4是第二個改變最多的基因，在PFDA實驗組其表達降低至對照的19.9％。進一步，利用QRT-PCR和Western blot證實DNA微陣列芯片分析結(jié)果。同時在Bel-7402細胞中得到進一步的驗證，PFDA處理組Bel-7402細胞與對照DMSO組Bel-7402相比，TC

17、F4與PLA2G2A的表達大幅度的降低。以上提示W(wǎng)NT/β-catenin信號通路在其中發(fā)揮重要作用。
　　2.2 PFDA對胃癌細胞(AGS)增殖能力的影響。
　　研究方法:通過CCK8和平板克隆形成實驗檢測PFDA對AGS細胞的影響，分析不同濃度PFDA對AGS細胞的影響和不同全氟化合物對AGS細胞的效應(yīng)。
　　研究結(jié)果:CCK8實驗發(fā)現(xiàn)，與DMSO對照細胞相比，用一定濃度的PFDA孵育細胞可以顯著增加細胞數(shù)量。此

18、外，AGS細胞的增殖速度根據(jù)PFDA濃度不同而不同，這種劑量依賴性效應(yīng)由肝細胞系Bel-7402得到驗證。平板克隆形成實驗進一步驗證，與對照組細胞對比，PFDA可以增強細胞集落形成能力超過70％，顯著高于在相同濃度下其他全氟化合物（PFOS和PFOA）。
　　2.3 PFDA通過抑制衰老促進AGS細胞增殖。
　　研究方法:為了探索參與PFDA誘導(dǎo)細胞增殖的細胞過程，利用流式細胞術(shù)，Western blot和SA-β-gal染

19、色來確定PFDA調(diào)節(jié)細胞增殖是通過凋亡、自噬還是衰老。
　　研究結(jié)果:流式細胞術(shù)顯示PFDA處理組和DMSO對照組凋亡細胞百分比無顯著差異;Western blot結(jié)果回示與自噬相關(guān)的p62或LC3(LC3-Ⅱ)亦無顯著差異。綜合分析上述實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)細胞凋亡和自噬都不是PFDA誘導(dǎo)細胞增殖的關(guān)鍵因素。SA-β-gal染色實驗結(jié)果顯示在PFDA處理組中與細胞衰老相關(guān)的β-半乳糖苷酶(SA-β-gal)活性明顯下降即SA-β-gal染

20、色的細胞數(shù)目減少和染色強度減弱。歸納上述試驗結(jié)果證明細胞衰老在PFDA誘導(dǎo)AGS增殖的過程中發(fā)揮重要和關(guān)鍵作用。
　　2.4 TCF4和sPLA2-ⅡA對PFDA處理組胃癌細胞的增殖影響。
　　研究方法:探討WNT/β-catenin信號通路的激活對細胞增殖的影響，利用CCK8，Western blot和QRT-PCR來確定WNT/β-catenin信號通路中的TCF4和sPLA2-ⅡA在PFDA處理組中是如何發(fā)揮促進AGS

21、細胞增殖的作用。
　　研究結(jié)果:AGS細胞給以TCF4過表達質(zhì)粒和PLA2G2A過表達質(zhì)粒處理后，CCK8結(jié)果評價AGS增殖能力的變化。轉(zhuǎn)染TCF4過表達質(zhì)粒和PLA2G2A過表達質(zhì)粒后，細胞的生長速率分別降低了60％和30％;然而，在TCF4過表達質(zhì)粒中加入干擾RNAPLA2G2A，細胞的增殖速率將會顯著提高，明顯高于僅轉(zhuǎn)染TCF4過表達質(zhì)粒的增殖速率。
　　Western blot和QRT-PCR結(jié)果回示:轉(zhuǎn)染TCF4過

22、表達質(zhì)粒和PLA2G2A過表達質(zhì)粒后，細胞恢復(fù)TCF4和sPLA2-ⅡA表達，PLA2G2A的表達與TCF4過表達質(zhì)粒和PLA2G2A過表達質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染劑量呈正相關(guān)性。然而，PLA2G2A過表達質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染劑量并不能影響TCF4表達。
　　概括上述結(jié)果:WNT/β-catenin信號通路中的轉(zhuǎn)錄因子TCF4及其下游的sPLA2-ⅡA可以調(diào)節(jié)PFDA促AGS細胞增殖的效應(yīng)。
　　2.5 sPLA2-ⅡA的表達可恢復(fù)細胞衰老并發(fā)揮抑

23、制AGS細胞增殖的作用.
　　研究方法:用SA-β-gal染色來檢測TCF4過表達質(zhì)粒、PLA2G2A過表達質(zhì)粒和干擾RNAPLA2G2A轉(zhuǎn)染AGS細胞后對細胞衰老的影響。
　　研究結(jié)果:用TCF4過表達質(zhì)粒和PLA2G2A過表達質(zhì)粒分別處理AGS細胞后，PLA2G2A的表達都獲得恢復(fù)，衰老的細胞數(shù)量明顯增多和細胞染色強度增強;加入干擾RNAPLA2G2A轉(zhuǎn)染后衰老細胞數(shù)量顯著減少和細胞染色強度也削弱。PFDA通過直接影響s

24、PLA2-ⅡA的表達來誘導(dǎo)細胞衰老抑制，達到刺激細胞增殖的效應(yīng)。
　　有趣的是，在實驗過程中我們發(fā)現(xiàn)PFDA處理AGS可顯著刺激IL-1β和IL18分泌， IL-1β和IL-18誘導(dǎo)與NLRP3炎癥小體的激活有相關(guān)性。 PFDA不僅可以通過WNT/β-catenin信號通路促進AGS細胞增殖，還可以刺激AGS細胞中的NLRP3炎癥小體聚集。
　　結(jié)論:
　　第一部分:WNT/β-catenin信號通路在PTC發(fā)生中的作

25、用。
　　人類全基因組寡核苷酸微陣列芯片分析PTC和相鄰正常組織發(fā)現(xiàn)，WNT10A/β-catenin信號通路在PTC發(fā)生過程中被激活。
　　參與WNT10A/β-catenin信號通路CCND1，RXRG，LEF1，MYC，CTNNB1，TPM3，WNT10A在PTC組織中表達呈上調(diào)狀態(tài)。
　　WNT10A/β-catenin信號通路的激活可促進PTC細胞增殖。
　　WNT10A/β-catenin信號通路的激

26、活抑制PTC細胞晚期凋亡并發(fā)揮干擾細胞周期的效應(yīng)。
　　激活WNT10A/β-catenin信號通路可增強PTC細胞的遷移能力。
　　第二部分:WNT/β-catenin信號通路在PFDA誘導(dǎo)胃癌細胞增殖中的作用
　　WNT/β-catenin信號通路中的sPLA2-ⅡA和TCF4在PFDA處理組AGS細胞與DMSO對照組AGS細胞中表達有顯著差異。
　　PFDA促進胃癌AGS細胞增殖。
　　PFDA通過抑

27、制細胞衰老施展促進胃癌AGS細胞增殖的作用。
　　WNT/β-catenin信號通路中的轉(zhuǎn)錄因子TCF4及其下游的sPLA2-ⅡA可以調(diào)節(jié)PFDA促AGS細胞增殖的效應(yīng)。
　　sPLA2-ⅡA的表達可恢復(fù)胃癌細胞衰老并抑制胃癌細胞增殖。
　　意義:
　　1.WNT/β-catenin信號通路在PTC發(fā)生及發(fā)展中發(fā)揮重要作用，WNT10A有可能為PTC臨床治療提供新靶點和新思路。
　　2.PFDA通過WNT/