Wnt-β-catenin信號通路在胚胎癌細(xì)胞增殖中的作用及其機(jī)制研究.pdf

1、目的及意義:睪丸生殖細(xì)胞瘤(testicular germ cell tumors,TGCT)是中青年男性中最常見的惡性腫瘤,近年來,其發(fā)病率呈上升趨勢?；グ?Teratocarcinoma)是一種較常見的TGCT,好發(fā)于新生兒和嬰幼兒,其惡性程度隨年齡增長而增高?；グ┲谐蟹只娜邔觼碓吹慕M織外,還含有未分化的胚胎癌細(xì)胞(Embryonic carcinoma cells,EC)。分離EC細(xì)胞,重新進(jìn)行小鼠皮下或腹腔注射,可產(chǎn)

2、生新的畸胎癌。這表明畸胎癌可來源于EC細(xì)胞。因此研究調(diào)控EC細(xì)胞增殖和分化的分子機(jī)制,對于了解畸胎癌的發(fā)生機(jī)制有重要意義。
　　 EC細(xì)胞是一類具有多分化潛能和自我復(fù)制能力的干細(xì)胞,可在體外無限增殖形成永生的細(xì)胞系,如小鼠的EC細(xì)胞系P19。在一定誘導(dǎo)條件下,EC細(xì)胞可分化為三胚層來源的各種細(xì)胞。EC細(xì)胞自我更新和分化的分子機(jī)制尚不完全清楚。
　　 Wnt／β—catenin信號通路是wnt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中的經(jīng)典通路,不僅

3、參與正常細(xì)胞和干細(xì)胞的增殖和分化,而且與腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)。探討Wnt／β—catenin在EC增殖和分化中的作用和作用機(jī)制,不僅有助于闡明畸胎癌形成的分子調(diào)控機(jī)制,而且能為畸胎癌及相關(guān)生殖細(xì)胞腫瘤的基因靶向治療提供有效的實驗依據(jù)。目前,關(guān)于wnt／β—catenin信號通路在畸胎癌中作用及其機(jī)制的研究在國內(nèi)外少有文獻(xiàn)報道。
　　 本研究對小鼠畸胎癌細(xì)胞系P19細(xì)胞進(jìn)行體外培養(yǎng),通過免疫熒光染色、BrdU標(biāo)記、MTT比色、RT—

4、PCR及Western blotting等方法檢測胚胎癌干細(xì)胞標(biāo)志性基因的表達(dá)及其變化規(guī)律。從而深入探討wnt／β—catenin信號通路在胚胎癌細(xì)胞增殖中的作用,并初步探討其可能的作用機(jī)制,為將來的基因診斷與基因治療提供有力的實驗與理論依據(jù)。
　　 研究方法:
　　 1.P19細(xì)胞體外傳代培養(yǎng)將細(xì)胞分為四組,分別為:正常對照組(Con組),添加SB216763組(SB組),添加全反式維甲酸(all trans—RA)組

5、(RA組)和添加SB216763與all trans—RA組(SB+RA組)。培養(yǎng)2d時,通過免疫熒光雙標(biāo)染色,檢測Oct4／β—catenin基因在四組細(xì)胞中的表達(dá)及其變化規(guī)律。
　　 2.細(xì)胞培養(yǎng)3d時,通過BrdU標(biāo)記,比較四組細(xì)胞間增殖情況；通過MTT比色,比較四組細(xì)胞間存活率的差異。
　　 3.細(xì)胞培養(yǎng)1d時,通過RT—PCR法檢測四組中Oct4、B—catenin等基因mRNA水平的表達(dá)及變化規(guī)律；通過Wes

6、tern blotting法,檢測四組中Oct4蛋白水平的表達(dá)及變化規(guī)律。
　　 4.細(xì)胞培養(yǎng)2d及7d時,通過免疫熒光染色、RT—PCR及Western blotting等方法檢測C—myc基因于四組中的表達(dá)及變化規(guī)律。
　　 結(jié)果:
　　 1.免疫熒光雙標(biāo)染色結(jié)果顯示,Con和RA組β—catenin主要分布于胞質(zhì),核內(nèi)分布較少；SB組和SB+RA組β—catenin主要分布于細(xì)胞核。RA組Oct4表達(dá)較其它

7、三組均明顯減少。SB組和SB+RA組B—catenin入核的細(xì)胞數(shù)和核內(nèi)Oct4分布明顯多于對照組和RA組。
　　 2.BrdU標(biāo)記結(jié)果顯示,RA組BrdU標(biāo)記細(xì)胞較對照組少,SB組和SB+RA組BrdU標(biāo)記細(xì)胞明顯多于對照組,差異有顯著意義(P<0.05)。MTT結(jié)果顯示,RA組OD值低于對照組,SB組和SB+RA組OD值明顯高于對照組,差異有顯著意義(P<0.05)；SB組和SB+RA組之間差異無顯著意義。
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8、.RT—PCR結(jié)果顯示,RA組Oct4 mRNA水平明顯低于對照組,SB組和SB+RA組Oct4 mRNA水平高于對照組；Sox2 mRNA水平在各組之間的差異類似于Oct4；Nanog和Stat3在四組之間差異不明顯；Western blotting結(jié)果顯示,RA組Oct4蛋白水平明顯低于對照組,SB組和SB+RA組Oct4蛋白水平高于對照組。
　　 4.培養(yǎng)2d和7d的免疫熒光染色結(jié)果顯示,SB組和SB+RA組C—myc核內(nèi)

9、表達(dá)明顯高于正常對照組和RA組。RT—PCR和Western blotting結(jié)果顯示,RA組C—myc基因表達(dá)低于對照組,SB組和SB+RA組C—myc基因表達(dá)高于對照組,SB組和SB+RA組兩組之間無明顯差異。
　　 結(jié)論:
　　 分析以上實驗結(jié)果,我們得出以下結(jié)論:
　　 1.wnt／β—catenin信號通路的激活促進(jìn)P19細(xì)胞中Oct4的表達(dá),抑制RA誘導(dǎo)的細(xì)胞分化。
　　 2.wnt／β—ca