Wnt-β-catenin信號通路在急性腎損傷修復(fù)過程中作用機(jī)制的研究.pdf

1、目的：Wnts組成的信號蛋白家族在腎臟的生長中起重要作用，但是他們的表達(dá)在成熟腎臟中被認(rèn)為是靜默的。Wnt信號的異常調(diào)節(jié)涉及許多不同組織類型的人類疾病的發(fā)病機(jī)制，急性腎損傷(AKI)是臨床常見病多發(fā)病，許多原因可導(dǎo)致急性腎損傷，其損傷機(jī)制最終大多是通過減少腎血流量導(dǎo)致缺血損傷。然而損傷的腎臟上皮細(xì)胞，與心臟和腦組織不同，在結(jié)構(gòu)和功能上是可以完全恢復(fù)的，雖然腎臟有強(qiáng)大的自我修復(fù)能力，但許多急性腎損傷的患者并不能完全恢復(fù)而轉(zhuǎn)為慢性腎臟病(C

2、KD)以至發(fā)展到終末期腎病(end stage renal disease， ESRD)。而目前臨床上對由AKI導(dǎo)致的CKD及ESRD的治療只是在控制其發(fā)展速度延緩病程，不能根本改善病人的預(yù)后。探討急性腎損傷的發(fā)病機(jī)制及其防治措施，阻斷其向CKD的發(fā)展一直為腎臟科領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。本研究利用Wnt/β-catenin信號通路轉(zhuǎn)基因報(bào)告鼠和C57BL/6野生型小鼠觀察Wnt/β-catenin經(jīng)典信號通路及其激動劑在正常腎臟和急性腎損傷后恢

3、復(fù)過程中腎臟的表達(dá)和調(diào)節(jié)；觀察經(jīng)典的Wnt信號通路的激活及對急性損傷后修復(fù)的影響。探討Wnt/β-catenin信號通路在急性腎損傷后的修復(fù)機(jī)制中的作用，為急性腎臟損傷后的干預(yù)治療提供一新思路。
　　 方法：
　　 (1)利用Wnt/β-catenin信號通路轉(zhuǎn)基因報(bào)告鼠（BAT-gal小鼠）建立單側(cè)腎臟缺血再灌注急性腎損傷（ischemina reprefersion injury, IRI）模型，了解小鼠體內(nèi)Wnt信

4、號分布和表達(dá)的變化，BAT-gal的表達(dá)等同于新奇的Wnt信號位點(diǎn)。IRI后于第0天、3天、5天不同時(shí)間點(diǎn)取腎臟組織，與正常小鼠比較，對整個(gè)腎臟及腎組織冰凍切片行X-gal染色，同時(shí)取血測血肌酐。
　　 (2)利用C57BL/6小鼠建立單側(cè)腎缺血再灌注損傷模型，分別與第0天、2天、5天、7天取血及留取腎臟組織標(biāo)本。采用ELISA方法檢測血肌酐的變化；Western blot檢測Wnt/β-catenin通路上的wnt4蛋白及其受

5、體Lrp6在腎缺血損傷后不同時(shí)間點(diǎn)表達(dá)的變化。同時(shí)對腎組織切片進(jìn)行腎病理分析，評定小管間質(zhì)損傷程度。另外于腎缺血再灌注后12hs始至48hs每12hs給予重組的Wnt/β-catenin信號通路的激動劑DKK2-C2腹腔內(nèi)注射，IRI后d5留取腎組織標(biāo)本，檢測腎組織病理和pLRP6蛋白的變化。
　　 (3)應(yīng)用BAT-gal轉(zhuǎn)基因報(bào)告鼠建立單側(cè)缺血再灌注腎損傷模型，分別與d0、d2、d5留取腎臟組織標(biāo)本。利用免疫熒光組織化學(xué)雙重

6、染色技術(shù)對腎組織切片行X-gal/CD31(內(nèi)皮細(xì)胞marker)、X-gal/PDGFβ(外周細(xì)胞marker)、X-gal/α-SMA(成纖維細(xì)胞/平滑肌細(xì)胞marker)、X-gal/F4/80(巨噬細(xì)胞marker)、X-gal/LTL(近曲小管marker)、X-gal/NKCC2(髓袢marker)、X-gal/DBA(集合管marker)雙染，觀察腎損傷后Wnt經(jīng)典信號通路參與修復(fù)過程中哪些細(xì)胞對Wnt/β-catenin

7、信號產(chǎn)生了應(yīng)答以及來源。
　　 (4)選擇在我院腎內(nèi)科住院并行腎病理檢查，符合急性腎小管壞死致急性腎損傷診斷的患者，分為腎病綜合征微小病變、微小病變并急性腎小管壞死的兩組病人，了解各組患者血肌酐的改變；石蠟切片行PAS染色觀察各組腎病理小管間質(zhì)損傷程度并進(jìn)行評分；星狼紅染色觀察各組病例腎組織中小管間質(zhì)中纖維化的程度；Ki67，Tunel染色觀察各組病例腎組織中小管上皮細(xì)胞凋亡和增殖的變化；免疫組化染色觀察各組病例腎組織中Wnt/

8、β-catenin信號蛋白表達(dá)的變化。
　　 結(jié)果：
　　 (1)成熟鼠腎組織X-gal染色，正常BAT-gal小鼠腎臟內(nèi)可見到Wnt/β-catenin信號主要分布在腎乳頭，而在皮質(zhì)和外髓沒有表達(dá)。在IRI后第3天和第5天可見到腎皮質(zhì)和外髓有大量的藍(lán)色陽性信號高表達(dá)。提示腎損傷后Wnt/β-catenin信號通路被誘導(dǎo)應(yīng)答；在對照組野生型小鼠腎內(nèi)Xgal染色陰性。
　　 (2)對腎組織切片進(jìn)行PAS染色結(jié)果分析

9、顯示：損傷腎臟的腎小管上皮細(xì)胞排列紊亂，可見明顯的腎小管上皮細(xì)胞脫落及基底膜裸露，管腔內(nèi)可見脫落的細(xì)胞和細(xì)胞碎片；7天時(shí)小鼠腎小管上皮細(xì)胞損傷面積較2天時(shí)明顯縮小。小管間質(zhì)損傷程度評分顯示在IRI后第2天損傷最重，第5天和第7天明顯好轉(zhuǎn)；對血肌酐監(jiān)測結(jié)果示IRI后逐漸增高，第2天時(shí)達(dá)峰值，以后逐漸下降，此兩項(xiàng)指標(biāo)說明IRI小鼠腎損傷后第2天始開始修復(fù)。
　　 western blot結(jié)果提示W(wǎng)nt4于IRI后2天增高，第5、7天

10、較第2天明顯增高；其共同受體phospho-Lrp6代表激活的Wnt/β-catenin信號，在IRI2天后增高明顯，而在無損傷成鼠腎組織中未能檢測到。
　　 給予DKK2的小鼠IRI后第5天phospho-Lrp6蛋白較對照組明顯增加，而腎組織小管上皮細(xì)胞損傷面積也明顯縮小。
　　 (3)X-gal染色顯示第2天損傷的腎臟皮質(zhì)和外髓質(zhì)層中可見少數(shù)腎小管出現(xiàn)Wnt信號的表達(dá)，主要表達(dá)在間質(zhì)的一些細(xì)胞中，第5天與第2天比較

11、Wnt信號表達(dá)明顯增強(qiáng)；損傷后腎臟組織X-gal染色顯示Lacz在腎小管上皮細(xì)胞被檢測到，免疫雙染提示為近曲小管和髓袢的上皮細(xì)胞對Wnt信號通路應(yīng)答，集合管上皮細(xì)胞上沒有Lacz陽性；在損傷后腎組織切片Lacz和細(xì)胞的雙標(biāo)記中顯示，腎間質(zhì)細(xì)胞中內(nèi)皮細(xì)胞和外周細(xì)胞對Wnt信號通路應(yīng)答，而巨噬細(xì)胞和成纖維細(xì)胞是陰性結(jié)果。計(jì)數(shù)腎皮質(zhì)和外髓質(zhì)β-gal染色陽性的內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)現(xiàn)，未損傷時(shí)腎皮質(zhì)無X-gal和CD31（內(nèi)皮細(xì)胞）及PDGFβ（外周細(xì)胞

12、）共染陽性的細(xì)胞，而IRI后第5天明顯增加。腎血管上對Wnt信號應(yīng)答的細(xì)胞是平滑肌細(xì)胞而不是內(nèi)皮細(xì)胞。
　　 (4)MCD組和MCD伴ATN組患者各20例，男性18例，女性22例，平均年齡31±12歲vs38±15歲；伴有ATN的患者腎病理PAS染色結(jié)果顯示一些腎小管上皮細(xì)胞脫落及基底膜裸露，管腔內(nèi)可見脫落的細(xì)胞和細(xì)胞碎片；與無ATN的對照組比腎小管損傷評分增加(17.15％vs3.84％P＜0.01)腎組織內(nèi)腎小管上皮細(xì)胞凋亡

13、也明顯增加（16.52±9.18vs5.14±3.28P＜0.001），細(xì)胞增殖亦有增加但兩組間差異不明顯(32.18±19.82vs30.09±12.81P＞0.05)，腎小管間質(zhì)內(nèi)膠原沉積面積明顯增多(1.39±1.25％vs0.12±0.09％P＜0.05);Wnt4蛋白主要在損傷的腎小管上皮細(xì)胞內(nèi)表達(dá)，偶見散在表達(dá)于腎小球；3-catenin的表達(dá)在腎小管上皮細(xì)胞內(nèi)，尤其是損傷的腎小管；兩組間比較有明顯差異（分別為1.64±0.

14、55％vs1.0±0.44％，8.02±4.37％vs3.83±2.08％P均＜0.05）。Wnt4的表達(dá)是與腎臟β-catenin的濃度密切相關(guān)(r=0.864)，他們的表達(dá)與患者腎小管損傷評分、腎小管上皮細(xì)胞凋亡及小管間質(zhì)膠原沉積成正相關(guān)；可能受細(xì)胞增殖數(shù)量增加不明顯的影響，使Wnt4和β-catenin兩種蛋白的表達(dá)與細(xì)胞增殖間沒有相關(guān)性。
　　 結(jié)論：
　　 (1)Wnt/β-catenin信號通路在正常成熟腎臟

15、內(nèi)有表達(dá)，主要位于腎乳頭區(qū)；IRI后Wnt/β-catenin信號通路被激活，在腎皮質(zhì)和外髓質(zhì)層表達(dá)。
　　 (2)IRI后2天損傷開始修復(fù)，Wnt蛋白的表達(dá)增強(qiáng)及其共同受體Lrp6磷酸化增加，于IRI后第5、7天持續(xù)增強(qiáng)，提示W(wǎng)nt/β-catenin通路參與缺血后急性腎損傷的修復(fù)機(jī)制；給予Wnt/β-catenin通路激動劑DKK2治療可增強(qiáng)此通路的作用，促進(jìn)急性腎損傷后的修復(fù)。
　　 (3)損傷腎臟中小管上皮細(xì)胞和