基于Wnt-β-catenin信號通路研究腎纖康顆粒抗腎間質(zhì)纖維化作用及機(jī)制.pdf

1、目的:
　　采用單側(cè)輸尿管梗阻(UUO)方法構(gòu)建大鼠腎間質(zhì)纖維化模型，以苯那普利為對照藥物，觀察中藥復(fù)方腎纖康顆粒對UUO模型大鼠腎功、腎小管間質(zhì)損傷指數(shù)、腎間質(zhì)纖維化程度以及對Wnt/β-catenin信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的影響，探討腎纖康顆粒抗腎間質(zhì)纖維化的作用及其機(jī)制。
　　方法:
　　將60只雄性Sprague Dawley(SD)大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組（SOR組）、UUO模型組（UUO組）、UUO模型+苯那普利治療組（

2、洛汀新組）、UUO模型+腎纖康顆粒治療組（腎纖康組），每組15只。SOR組僅切開腹腔而不結(jié)扎輸尿管，其余各組均構(gòu)建UUO模型，從術(shù)后第一天開始給藥，腎纖康組給予腎纖康顆粒（4.2g/kg·d）灌胃治療，洛汀新組給予苯那普利（10mg/kg·d）灌胃治療，SOR組和UUO組給予等體積蒸餾水灌胃。分別于術(shù)后第7天、14天和21天每組隨機(jī)選擇5只大鼠處死，稱取大鼠腎重和體重，計(jì)算腎臟肥大指數(shù)（腎重/體重，KW/BW），檢測24小時尿蛋白定量、

3、肌酐(Scr)、尿素氮（BUN）、腎臟HE及Masson染色，采用免疫組織化學(xué)染色法和Western blot檢測腎組織Wnt4、β-catenin和α-SMA蛋白的表達(dá)，Real time PCR檢測腎組織Wnt4、β-catenin和α-SMA mRNA的表達(dá)水平。
　　結(jié)果:
　　1.體重及KW/BW變化:與SOR組相比，其余各組大鼠各時間點(diǎn)體重均減輕，而KW/BW升高（P＜0.05）;與UUO組相比，腎纖康組和洛汀新

4、組體重各時間點(diǎn)均明顯升高，KW/BW在第7天和14天明顯降低(P＜0.05)，而在第21天較UUO組升高(P＜0.05);腎纖康組和洛汀新組治療效果相當(dāng)（P＞0.05）。
　　2.24小時尿蛋白定量:每組大鼠各時間點(diǎn)24小時尿蛋白定量組內(nèi)比較和組間比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05）。
　　3.腎功能指標(biāo):與SOR組相比，其余各組大鼠各時間點(diǎn)Scr和BUN均有不同程度升高(P＜0.05);與UUO組相比，腎纖康組和洛汀新組

5、Scr和BUN水平均明顯降低（P＜0.05）;腎纖康組與洛汀新組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05）。
　　4.腎臟病理變化:HE和Masson染色顯示，SOR組各時間點(diǎn)腎小球和腎小管形態(tài)正常，未見腎纖維化病理改變;其余各組腎皮質(zhì)逐漸變薄，可見不同程度腎小管管腔萎縮或閉塞、上皮細(xì)胞空泡變性和炎性細(xì)胞浸潤，間質(zhì)中藍(lán)染膠原纖維逐漸增多，21天達(dá)到高峰;與SOR組相比，其余各組大鼠各時間點(diǎn)腎小管間質(zhì)損傷指數(shù)和膠原染色陽性面積均明顯增加(

6、P＜0.05)，與UUO組相比，腎纖康組和洛汀新組各時間點(diǎn)腎小管間質(zhì)損傷指數(shù)和膠原染色陽性面積均明顯降低(P＜0.05)，腎纖康組與洛汀新組相比差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。
　　5.免疫組織化學(xué)染色檢查
　　5.1α-SMA: SOR組中α-SMA僅在腎小球血管平滑肌細(xì)胞上少量表達(dá)，各時間點(diǎn)表達(dá)無變化，其余各組大鼠UUO術(shù)后腎小管上皮細(xì)胞及間質(zhì)細(xì)胞中可見陽性表達(dá)，隨著梗阻時間延長表達(dá)逐漸增加(P＜0.05);與UUO

7、組相比，腎纖康組和洛汀新組各時間點(diǎn)表達(dá)明顯減少(P＜0.05);腎纖康組和洛汀新組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。
　　5.2β-catenin和Wnt4:β-catenin和Wnt4在SOR組腎小管上皮細(xì)胞基底側(cè)少量表達(dá)，隨著時間延長表達(dá)均無明顯變化，其余各組大鼠UUO術(shù)后在腎小管上皮細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)逐漸增加（P＜0.05）;與UUO組相比，腎纖康組和洛汀新組各時間點(diǎn)表達(dá)明顯減少（P＜0.05）;腎纖康組和洛汀新組比較差異無統(tǒng)

8、計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。
　　5.3相關(guān)性分析:UUO組腎組織β-catenin和Wnt4分別與α-SMA表呈正相關(guān)（r分別為0.982，0.934;P均＜0.05）。
　　6.Western blot檢測
　　Wnt4、α-SMA、β-catenin蛋白在SOR組大鼠腎臟中表達(dá)較低，而在UUO組中隨著梗阻時間延長表達(dá)逐漸增加(P＜0.05);與UUO組相比，腎纖康組和洛汀新組中上述蛋白表達(dá)均明顯下降(P＜0.05)

9、，腎纖康組和洛汀新組表達(dá)量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。
　　7.Real time PCR檢測
　　Wnt4、α-SMA、β-catenin mRNA在SOR組有少量表達(dá)，UUO術(shù)后表達(dá)逐漸增高，21天達(dá)到最高;與SOR組相比，其余各組均明顯升高(P＜0.05)，與UUO組相比，腎纖康組和洛汀新組腎組織中Wnt4、α-SMA、β-catenin mRNA量均明顯下降(P＜0.05)，腎纖康組和洛汀新組表達(dá)量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)

10、意義(P＞0.05)。
　　結(jié)論:
　　1.腎纖康顆?？梢越档蚒UO大鼠Scr、BUN、腎小管間質(zhì)損傷指數(shù)及腎間質(zhì)膠原纖維面積，作用效果與苯那普利相當(dāng)。
　　2.Wnt/β-catenin信號通路在UUO大鼠模型中活性增強(qiáng)，其關(guān)鍵信號蛋白β-catenin和Wnt4的表達(dá)與腎纖維化程度呈正相關(guān)。
　　3.腎纖康顆粒可能通過抑制Wnt/β-catenin信號通路而減少α-SMA及膠原纖維的表達(dá)，延緩UUO大鼠腎間質(zhì)