Hedgehog信號通路介導血管周細胞參與腎間質纖維化的機制研究.pdf

1、研究背景和目的:
　　腎間質纖維化（Renal interstitial fibrosis，RIF）是各種慢性腎病隨病程進展到最終階段的相同病理生理表現(xiàn)，嚴重威脅著患者健康。該病變表現(xiàn)腎間質中肌成纖維細胞顯著增殖，細胞外膠原分泌增多，腎單位損傷及功能進行性下降為特征。因此，為探索行之有效的防治措施，需徹底明確該病變機制。肌成纖維細胞的來源一直是本病變探討的焦點，相關文章表明，其來源或許涉及多種細胞。長期以來，腎小管上皮細胞-間葉細

2、胞轉分化（Epithelial-mesenchymal transition，EMT）機制得到眾多學者首肯，但近來有學者提出不同觀點，認為RIF與受Hh信號通路調節(jié)的周細胞的關系似乎更大。因此，本研究擬通過對Hh信號通路激活時周細胞各項特征變化的檢測來探索Hh信號通路是否參與了周細胞向肌成纖維細胞方向轉分化，并且是否可以被Hh信號通路的相應配體所干預。
　　材料與方法:
　　選用健康BALB/c乳鼠，雌雄不限，通過乳鼠腎細胞

3、原代培養(yǎng)，用免疫磁珠分選技術分離純化，并將所獲得的細胞通過形態(tài)學觀察和免疫細胞化學NG2、SMA和CD31檢測，鑒定是否符合周細胞特征，經(jīng)三次傳代培養(yǎng)，收集周細胞。將已經(jīng)純化的周細胞分為對照組、SHH組和SHH+CPA組三組。對照組均于0h、24 h分別加終濃度為0.2％BSA的PBS; SHH組于0h、24 h分別加終濃度為1.5ng/mL SHH蛋白;SHH+CPA組在SHH組基礎上于每個SHH的添加時間點前2h加終濃度為0.25μ

4、m/mLCPA干預。干預結束后，均行免疫細胞化學SMA檢測、BrdU摻入實驗檢測、細胞劃痕實驗檢測和Ⅰ型膠原ELISA檢測。
　　結果:
　　1.通過乳鼠腎細胞原代培養(yǎng)，免疫磁珠分離純化，經(jīng)倒置相差顯微鏡觀察，形態(tài)學符合周細胞特征:細胞寬大扁平，形狀不規(guī)則，并伴數(shù)個突起，胞核居中，單核或雙核;NG2和SMA免疫細胞化學染色陽性表達，CD31免疫細胞化學染色陰性表達，證實為周細胞。
　　2.細胞經(jīng)干預行上述檢測，免疫細胞

5、化學SMA檢測:對照組細胞質中陽性表達程度為121.3±13.7，SHH組為168±21.0，SHH+CPA組為132.1±19.8，即SHH組陽性表達程度高于對照組，SHH+CPA組陽性表達程度低于SHH組，差異比較均有統(tǒng)計學意義(P＜0.05);細胞劃痕實驗檢測:對照組細胞遷徙距離24h、36h和48h分別為8.2000±1.4832μm、16.8000±1.0955μm、25.4000±1.1402μm，SHH組分別為15.600

6、0±2.0736μm、21.8000±1.9235μm、35.2000±0.8367μm， SHH+CPA組分別11.4000±1.9494μm、18.4000±1.5166μm、28.2000±0.4472μm，即相同時間點SHH組細胞遷徙距離多于對照組，SHH+CPA組細胞遷徙距離少于SHH組，差異比較均有統(tǒng)計學意義(P＜0.05); BrdU摻入實驗檢測:對照組增殖活性為0.52±0.11，SHH組為0.67±0.12，SHH+C

7、PA組為0.55±0.09，SHH組細胞增殖活性高于對照組，SHH+CPA組細胞增殖活性低于SHH組，兩組差異比較均有統(tǒng)計學意義(P＜0.05);Ⅰ型膠原ELISA檢測:對照組為5.36±0.52，SHH組為9.22±0.68，SHH+CPA組為7.8±0.63，即SHH組細胞產(chǎn)生Ⅰ型膠原的量多于對照組，SHH+CPA組細胞產(chǎn)生Ⅰ型膠原的量少于SHH組，兩組差異比較均有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。
　　結論:
　　1.利用免