腺苷A2A受體調(diào)控腎間質(zhì)纖維化的機(jī)制研究.pdf

1、研究背景:
　　 各種形式的終末期腎病，無關(guān)他們的病因是什么，進(jìn)行性的腎間質(zhì)纖維化和腎小管萎縮是其共同的病理特征。腎間質(zhì)纖維化由炎性因素促發(fā)，繼之出現(xiàn)腎小管上皮細(xì)胞向間充質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化。早期的抗炎治療策略對(duì)于預(yù)防腎間質(zhì)纖維化的進(jìn)程及其重要。然而目前還沒有有效的治療策略可以采用，因此，尋找新的治療靶點(diǎn)及其緊迫。
　　 持續(xù)損傷后的腎臟炎癥，例如IgA腎病和狼瘡性腎炎，作為啟動(dòng)因素，建立了纖維化的舞臺(tái)，促發(fā)了組織纖維化的發(fā)生。在

2、這個(gè)病理過程中，炎性細(xì)胞，如單核巨噬細(xì)胞和淋巴細(xì)胞發(fā)揮了重要作用。腎間質(zhì)纖維化特點(diǎn)就是肌成纖維細(xì)胞的激活和基質(zhì)蛋白的沉積，主要包括Ⅰ型膠原和Ⅲ型膠原。在腎間質(zhì)纖維化的病程中，通過EMT產(chǎn)生了大量的表達(dá)α-SMA肌成纖維細(xì)胞，其是基質(zhì)蛋白的主要來源。單側(cè)輸尿管梗阻(UUO)模型一直被用來闡明腎間質(zhì)纖維化的發(fā)生機(jī)制。單核巨噬細(xì)胞和淋巴細(xì)胞的浸潤(rùn)及淋巴細(xì)胞的功能失常在UUO誘導(dǎo)的腎間質(zhì)纖維化的模型中起重要的致病作用。在這個(gè)模型中，細(xì)胞水平上，

3、腎小管擴(kuò)張導(dǎo)致腎小管上皮細(xì)胞失去上皮細(xì)胞的特點(diǎn)，并獲得間充質(zhì)細(xì)胞性狀，如α-SMA的表達(dá)和肌動(dòng)蛋白的重組。因此，腎小管上皮細(xì)胞通過EMT過程成為腎肌成纖維細(xì)胞的主要來源。在分子水平上，TGF-β1通過激活其下游的Rho/ROCK信號(hào)傳導(dǎo)通路在EMT中起著關(guān)鍵的作用。
　　 最近，腺苷A2A的受體(A2AR)作為一種新的炎癥調(diào)節(jié)因子調(diào)控炎癥過程和組織修復(fù)。藥理學(xué)研究表明，A2AR激動(dòng)劑CGS21680和ATL193，可以有效地抑制

4、炎癥，激活A(yù)2AR導(dǎo)致腎小球腎炎和腎臟損傷的減輕。此外，最近的研究發(fā)現(xiàn)，在肝星狀細(xì)胞，激活A(yù)2AR可以抑制Rho/ROCK1。以上所有表明，調(diào)控A2AR對(duì)炎癥、EMT事件起著重要的調(diào)節(jié)作用。因此，我們推測(cè)，激活A(yù)2AR可以抑制炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，EMT事件和促纖維化因子，從而防止隨之而來的腎間質(zhì)纖維化。相反，A2AR失活可能導(dǎo)致腎間質(zhì)纖維化惡化。
　　 使用UUO引起的腎間質(zhì)纖維化實(shí)驗(yàn)小鼠模型，我們從多方面評(píng)估了A2AR在腎間質(zhì)纖維化

5、中的調(diào)節(jié)作用，包括間質(zhì)淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)，細(xì)胞EMT的生物標(biāo)志物，促纖維化因子TGF-β1的表達(dá)及其下游Rho/ROCK1途徑，以及由此產(chǎn)生的細(xì)胞外基質(zhì)的積累。
　　 研究目的:
　　 明確腺苷A2AR對(duì)單側(cè)輸尿管梗阻(UUO)小鼠腎間質(zhì)纖維化表型的影響。探討腺苷.A2AR影響腎間質(zhì)纖維化的分子機(jī)制。
　　 方法:
　　 建立C57背景小鼠腎間質(zhì)纖維化動(dòng)物模型，采用HE染色、Masson染色、免疫組化對(duì)UUO術(shù)

6、后3天、7天、14天三個(gè)時(shí)間結(jié)點(diǎn)進(jìn)行病理學(xué)檢測(cè)及纖維化程度進(jìn)行評(píng)估，計(jì)算機(jī)輔助圖像分析用于評(píng)估腎間質(zhì)纖維化情況及炎性細(xì)胞浸潤(rùn)情況。
　　 藥理學(xué)干預(yù)實(shí)驗(yàn)，研究腺苷A2AR對(duì)不同處理組表型的影響，采用敲除腺苷A2AR及CGS21680激活腺苷A2AR，對(duì)三個(gè)時(shí)間結(jié)點(diǎn)的不同處理組，包括假手術(shù)對(duì)照組、野生型+梗阻組、A2AR激活+梗阻組、A2AR敲除+梗阻組表型進(jìn)行分析，明確A2AR對(duì)腎間質(zhì)纖維化表型的影響。
　　 進(jìn)一步明確

7、腺苷A2AR影響腎間質(zhì)纖維化的分子機(jī)制，使用Western-blot、免疫組化對(duì)影響腎間質(zhì)纖維化的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，腎小管上皮細(xì)胞向間充質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化(EMT)進(jìn)行檢測(cè)。動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)腎小管上皮細(xì)胞標(biāo)志E-cadherin及肌成纖維細(xì)胞的表面標(biāo)志α-SMA的變化。
　　 免疫組化明確EMT啟動(dòng)因素炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)的種類，image pro plus計(jì)算機(jī)輔助圖像定量分析，分析A2AR對(duì)不同組別細(xì)胞浸潤(rùn)的影響。
　　 使用RT-qPCR檢測(cè)腺苷

8、A2AR對(duì)致纖維化因子TGF-β1和RHO/ROCK1信號(hào)途徑的影響。
　　 結(jié)果:
　　 激活腺苷A2AR減輕了細(xì)胞外基質(zhì)膠原的沉積。
　　 激活腺苷A2AR抑制了EMT的進(jìn)程。
　　 激活腺苷A2AR減少了促纖維化因子的表達(dá)。
　　 腺苷A2AR介導(dǎo)的腎間質(zhì)纖維化保護(hù)作用源于激活腺苷A2AR抑制了T淋巴細(xì)胞的浸潤(rùn)。
　　 與之相反的是，A2AR失活將對(duì)以上表型，發(fā)揮完全相反的作用。