腺苷A2A受體在骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞治療肝纖維化的機(jī)制研究.pdf

1、目的：
　　肝纖維化是急性或慢性肝損傷后細(xì)胞外基質(zhì)積聚而形成的，是肝硬化和肝細(xì)胞癌（HCC）的共同病理過程，長期的乙型肝炎、丙型肝炎感染、酒精性肝炎和膽道疾病等都會(huì)引起肝纖維化。最近的證據(jù)表明，巨噬細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、膽管細(xì)胞，內(nèi)皮細(xì)胞在肝纖維化的形成中也可起到關(guān)鍵作用，然而其潛在的機(jī)制仍沒有研究清楚。近幾年，乙型肝炎的治療研究取得了明顯的進(jìn)步，與之相關(guān)的大量臨床證據(jù)表明，肝纖維化是可逆的。目前，關(guān)于間充質(zhì)干細(xì)胞（MSCs）治療各種

2、疾病的報(bào)道越來越多。這些細(xì)胞不僅可以為其他干細(xì)胞提供合適的微環(huán)境，還可以分化為多種間質(zhì)來源的細(xì)胞，包括脂肪、骨、軟骨。作為一種有效的免疫調(diào)節(jié)劑，間充質(zhì)干細(xì)胞具備抗凋亡、抗炎和促增殖的特性，這是治療肝臟疾病的理想特性。此外，間充質(zhì)干細(xì)胞還具有潛在的緩解炎癥和損傷的功能。過去的研究已經(jīng)描述了MSCs的負(fù)向免疫調(diào)節(jié)效應(yīng)與調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Treg）和Th17細(xì)胞密切相關(guān)，提示Th17細(xì)胞的增多和/或Treg細(xì)胞的缺乏與肝纖維化發(fā)病機(jī)制相關(guān)。然而，

3、對(duì)于肝纖維化，很少有研究人員在骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞和T細(xì)胞的上述作用機(jī)制中做過深入研究。作為一種內(nèi)源性嘌呤核苷，腺苷介導(dǎo)多種生理功能通過4個(gè)細(xì)胞表面受體（A1、A2A，A2B和A3）。A2A受體（A2AR）是一個(gè)鳥苷結(jié)合蛋白偶聯(lián)受體（GPCR）家族和重要的藥物靶點(diǎn)，與治療癌癥、炎癥、鐮狀細(xì)胞病、缺血再灌注損傷、感染性疾病、糖尿病腎病、神經(jīng)障礙等密切相關(guān)。以往的研究報(bào)道，A2AR的激活能減少中性粒細(xì)胞并減輕由哮喘、急性肺損傷、關(guān)節(jié)炎和炎癥性腸

4、病引起的炎癥。值得注意的是，最近有一些研究表明，胞外腺苷的分泌物及其信號(hào)通過腺苷受體（ARS）在多種纖維化疾病的發(fā)病機(jī)制中起著舉足輕重的作用。作為一種間充質(zhì)干細(xì)胞，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（BMSCs）具有相似的特點(diǎn)，而且已經(jīng)有許多研究報(bào)道了BMSCs在肝纖維化中的應(yīng)用，這也是我們選擇BMSCs來進(jìn)行我們實(shí)驗(yàn)的原因。在實(shí)驗(yàn)中，我們的目標(biāo)是提供更多關(guān)于BMSCs治療肝纖維化的證據(jù)，但進(jìn)一步的研究仍然是必要的。
　　方法：
　　在決定造

5、模方案后，取200只C57BL/6小鼠，進(jìn)行肝纖維化造模。腹腔注射CCl4和植物油的混合物（2:3（v/v））（2ml／kg體重），一周兩次，總共12周，取最終存活下來的18只小鼠用于拮抗劑濃度的摸索，分為A2A受體拮抗劑的用量分別為0.05mg/kg，0.1 mg/kg和0.2mg/kg。最終確定濃度為0.1 mg/kg后，取18只存活的小鼠分成四組，即生理鹽水(NS)組、拮抗劑(AA)組、干細(xì)胞+拮抗劑(BM+AA)組和干細(xì)胞(BM

6、)組，我們先給生理鹽水組和拮抗劑組小鼠尾經(jīng)脈注射1ml生理鹽水，給干細(xì)胞+拮抗劑組和干細(xì)胞組注射1ml總共含106個(gè)細(xì)胞數(shù)的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞。然后再給生理鹽水組和干細(xì)胞組腹腔注射1ml生理鹽水，給拮抗劑組和干細(xì)胞+拮抗劑組注射1ml稀釋過的A2A受體拮抗劑。14天后，先用水合氯醛麻醉小鼠，然后處死小鼠，取肝臟、脾臟和血液進(jìn)行HE染色、Masson染色、流式分析、PCR、WB和Elisa的檢驗(yàn)。
　　結(jié)果：
　?、旁炷：?，HE

7、染色顯示大量肝細(xì)胞腫脹壞死，炎性細(xì)胞浸潤，Masson染色顯示纖維組織增生，肝臟小葉結(jié)構(gòu)紊亂，證明造模成功。當(dāng)小鼠用A2A受體拮抗劑處理后，假小葉形成更加明顯，而用干細(xì)胞處理后，肝纖維化程度對(duì)比生理鹽水組有很大程度的好轉(zhuǎn)，且在拮抗劑的基礎(chǔ)上加干細(xì)胞，纖維化狀態(tài)也有好轉(zhuǎn)。⑵Th17的百分比由高到低分別為拮抗劑組、生理鹽水組、干細(xì)胞+拮抗劑組和干細(xì)胞組，結(jié)果和IL-6、TNF-ɑ和IL-17的量一致，而Treg的結(jié)果剛剛相反，差異均具有統(tǒng)計(jì)

8、學(xué)意義。⑶Foxp3基因的表達(dá)量隨著干細(xì)胞的注射相比生理鹽水組有所上調(diào)，而在注射了A2A受體拮抗劑后下調(diào)，Rorc基因的表達(dá)量和Foxp3基因相反。A2AR基因的表達(dá)量隨著注射干細(xì)胞后上調(diào)。在蛋白層面上， Foxp3、Rorc和A2AR的蛋白表達(dá)量與PCR結(jié)果相符。
　　結(jié)論：
　　①干細(xì)胞治療能緩解肝纖維化，A2A受體拮抗將加重肝纖維化。②干細(xì)胞改善肝纖維化的同時(shí)，Th17細(xì)胞下調(diào)，Treg細(xì)胞上調(diào)，A2A受體拮抗時(shí)相反。