人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞對肺纖維化模型的治療作用研究.pdf

1、第一部分BLM誘導(dǎo)肺纖維化模型與鑒定
　　目的：建立博萊霉素（BLM）誘導(dǎo)的肺纖維化（pulmonary fibrosis，PF）小鼠模型，為采用人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞（HUC-MSCs）治療PF模型做前期準(zhǔn)備。
　　方法：將C57BL/6小鼠隨機(jī)分為PBS（空白對照組）、BLM（模型組）2組，每組18只。腹腔注射10％水合氯醛麻醉后，行氣管滴注術(shù)，PBS組、BLM組分別給予50μl PBS和50 BLM（5mg/kg）。分別在

2、第7d、14d、21d處死小鼠并收集肺組織標(biāo)本。H&E染色觀察肺組織病理損傷并進(jìn)行評分、Masson染色觀察肺組織中膠原沉積并進(jìn)行評分、羥脯氨酸（HYP）檢測肺組織中膠原含量。
　　結(jié)果：經(jīng)氣管滴注BLM7d、14d、21d后，BLM與PBS相比較，體重和生存率明顯下降，H&E染色病理結(jié)果表現(xiàn)為由初期肺泡炎癥和中后期纖維化程度逐漸加重；Masson染色可見隨著時(shí)間變化肺組織出現(xiàn)條狀或者片狀藍(lán)色膠原聚集；HYP檢測顯示肺部膠原含量逐

3、漸升高，尤其是在21d后，兩組差異最大且有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)論：經(jīng)氣管滴注給予BLM21天后，可以建立穩(wěn)定的肺纖維化鼠模型。
　　第二部分人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞對肺纖維化模型的治療作用
　　目的：確定采用 HUC-MSCs治療 PF模型的最佳時(shí)間點(diǎn)，研究HUC-MSCs對PF模型的保護(hù)作用，探討其作用可能存在的分子機(jī)制。
　　方法：將C57BL/6小鼠隨機(jī)分為 PBS+PBS（空白對照組），PBS+HUC-MS

4、Cs（干細(xì)胞對照組），BLM+PBS（模型組），BLM+HUC-MSCs（干細(xì)胞治療組）4組，每組10只。腹腔注射麻醉后行氣管滴注術(shù)，PBS+PBS組、PBS+HUC-MSCs組和 BLM+PBS、BLM+HUC-MSCs分別滴注50μl PBS和50μl BLM（5mg/kg），分別在1h、12h、24h三個時(shí)間點(diǎn)后PBS+HUC-MSCs組和BLM+HUC-MSCs組經(jīng)氣管滴入80μl HUC-MSCs懸濁液（1×106/只），PB

5、S+PBS組、BLM+PBS組氣管滴入PBS（80μl/只），在給予HUC-MSCs后的第21天收集肺組織標(biāo)本，用H&E及Masson染色觀察肺組織中肺泡炎癥及膠原改變與評分，以確定最佳給予細(xì)胞時(shí)間點(diǎn)；重新建模分組，方法及分組情況同前，在最佳時(shí)間點(diǎn)給予HUC-MSCs/PBS，在21天時(shí)收集肺組織及BALF液，用H&E及Masson染色觀察肺組織病理改變與評分，用ELISA方法檢測各組BALF液中HYP、TGF-β1、TNF-α、IFN

6、-γ、IL-1β蛋白表達(dá)，并用CM-Di染料標(biāo)記HUC-MSCs，觀察其在肺組織中分布與遷移情況。
　　結(jié)果：H&E及Masson染色病理結(jié)果顯示：氣管滴入BLM后分別在1h、12h、24h給予HUC-MSCs治療后，與PF組相比，治療組肺泡炎癥及膠原沉積均明顯減輕，且BLM滴入1h后立即給予HUC-MSCs治療效果最佳；同時(shí)，模型組相比，立即給予HUC-MSCs治療組可降低小鼠的死亡、恢復(fù)體重減輕與缺氧等臨床表現(xiàn)，H&E染色觀察

7、肺泡炎癥及出血減輕，Masson染色顯示膠原沉積減少，ELISA方法檢測到HYP、TGF-β1、TNF-α、IL-1β明顯降低而IFN-γ升高。CM-Dil示蹤結(jié)果顯示：其可高效率的標(biāo)記 HUC-MSCs。氣管滴注CM-Dil標(biāo)記的HUC-MSCs后，分別在1h、24h、7d、14d、21d均可在肺組織中觀察到 HUC-MSCs分布，且 HUC-MSCs并未分化為肺泡Ⅱ型細(xì)胞的特異性蛋白SP-C和上皮細(xì)胞黏鈣蛋白E-cadherin。<