人臍帶間充質(zhì)干細胞治療大鼠肝硬化的實驗研究.pdf

1、目的:研究人臍帶間充質(zhì)干細胞(UC-MSC)和骨髓間充質(zhì)干細胞(BM-MSC)的基因表達差異和免疫調(diào)控能力，然后采用人臍帶間充質(zhì)細胞治療肝硬化大鼠，研究肝臟在治療前后基因表達的變化;最后研究肝細胞表達的NAT8酶在臍帶間充質(zhì)干細胞治療肝硬化過程中的作用。
　　方法:首先從人臍帶的血管外下層分離培養(yǎng)UC-MSC，然后從人骨髓樣本中分離培養(yǎng)BM-MSC，進行細胞形態(tài)學(xué)觀察、生長觀察，以及流式細胞術(shù)鑒定其細胞表型，檢測這兩種細胞向成骨細

2、胞、軟骨細胞和脂肪細胞的分化能力，并利用基因芯片檢測了這2種細胞的基因表達差異。其次利用皮下注射四氯化碳方法建立大鼠肝硬化動物模型，將人UC-MSC通過尾靜脈注射途徑對肝硬化大鼠模型進行治療，利用血清學(xué)生化指標(biāo)檢測和組織學(xué)膠原纖維染色證明UC-MSC的治療效果，最后提取造模前后和治療前后的肝臟RNA，進行表達譜芯片雜交并對芯片結(jié)果數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。對篩選出的NAT8酶進行了PCR驗證、WB驗證和功能分析，通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染NAT8真核表達質(zhì)

3、粒和小分子干擾RNA的方法，在L02肝細胞株中上調(diào)和下調(diào)NAT8的表達，檢測其對雙氧水造成的肝細胞凋亡的逆轉(zhuǎn)作用。
　　結(jié)果:細胞表型檢測和誘導(dǎo)分化實驗證明，我們從骨髓和臍帶中培養(yǎng)得到的貼壁細胞表型符合間充質(zhì)細胞特征，這些細胞均能夠表達例如CD29、CD44、CD73、CD90、CD105、CD106和CD166等特征表面分子，同時不表達造血和內(nèi)皮細胞標(biāo)志如CD14、CD31、CD34和CD45分子。在合適的體外誘導(dǎo)條件下，在體外

4、培養(yǎng)中向造骨細胞、軟骨細胞和脂肪細胞分化，在UC-MSC中上調(diào)的表達基因主要涉及器官的生長發(fā)育和細胞分化，而BM-MSCs中上調(diào)表達的基因主要包括骨骼發(fā)育和免疫調(diào)控。然后我們利用血清學(xué)檢測和組織病理學(xué)染色結(jié)果證明，我們利用四氯化碳法成功建立了大鼠肝硬化模型，且UC-MSC治療可以顯著地改善肝損傷。芯片分析結(jié)果顯示與對照組相比，UC-MSC治療上調(diào)了補體凝血相關(guān)基因，下調(diào)細胞增殖、細胞周期和膠原合成等相關(guān)基因。其中NAT8酶在MSC介導(dǎo)的

5、肝細胞抗損傷修復(fù)中發(fā)揮重要作用。在體外培養(yǎng)的肝細胞株L02實驗中，MSC條件上清可顯著改善雙氧水引起的細胞凋亡，上調(diào)NAT8酶可以減少雙氧水引起的細胞凋亡，而下調(diào)NAT8酶則加劇了細胞凋亡。
　　結(jié)論:UC-MSC增殖快，表達更多的生長發(fā)育相關(guān)基因，更適合于用于異體間細胞輸注治療，在UC-MSC治療肝硬化大鼠逆轉(zhuǎn)肝細胞損傷的過程中，可能通過上調(diào)了補體凝血相關(guān)基因，抑制細胞增殖和膠原沉著發(fā)揮治療作用。其中NAT8酶在MSC介導(dǎo)的肝細