骨髓間充質(zhì)干細胞體內(nèi)移植治療肝硬化的初步實驗研究.pdf

1、目的：肝硬化是肝臟發(fā)生的慢性、進行性改變。病理上以肝組織彌漫性纖維化、假小葉和再生結節(jié)形成為特征，臨床表現(xiàn)為肝功損害和門脈高壓。肝硬化是我國常見疾病和主要死亡病因之一。目前，臨床上針對肝硬化的各種治療方法均存在某些弊端，尚無安全有效的最佳療法。近年來，骨髓間充質(zhì)干細胞(BMSCs)因其具有多向分化潛能而成為備受關注的種子細胞。鑒于此，本實驗以體外分離培養(yǎng)BMSCs并建立肝硬化動物模型為基礎，通過體內(nèi)直接輸注BMSCs來檢測其是否可以改善

2、受損肝臟的肝功能，為BMSCs臨床治療肝硬化的可行性提供實驗依據(jù)。 實驗方法: 一、BMSCs的分離純化及表面標志物的檢測 1、BMSCs的分離純化選取四周齡100-120g健康雄性SD大鼠，獲取BMSCs，在37℃、5％CO<,2>條件下，用含10％胎牛血清的L-DMEM培養(yǎng)液進行貼壁培養(yǎng)。當細胞達到80％-90％融合時，以1∶2的比例進行傳代培養(yǎng)，三代后獲取較為純化的BMSCs。 2、BMSCs的生長

3、曲線測定取生長良好的1代和3代細胞，消化后以1×10<'4>/ml的密度接種于24孔板內(nèi)。此后，每天取三孔計數(shù)，并計算均值，連續(xù)9天。據(jù)此繪出BMSCs的生長曲線。 3、BMSCs表面標記物的測定取3代較為純化BMSCs細胞，應用免疫熒光法檢測BMSCs表面標記物CD29、CD44的陽性表達并計算其陽性率。 二、大鼠肝硬化模型的建立健康雌性SD大鼠80只，體重150-180g，飼養(yǎng)一周后隨機分為三組：正常組(20只)，普

4、食普水；實驗對照組(30只)和實驗組(30只)均皮下注射40％四氯化碳和60％植物油混合液，0.3ml/kg體重，每周兩次，連續(xù)注射八周，實驗期間給予正常飲食。八周后取正常組、實驗組和實驗對照組大鼠肝臟作病理切片觀察肝臟改變情況。 三、BMSCs輸注后肝功測定向?qū)嶒灲M大鼠體內(nèi)輸注純化的BMSCs，分別于一、二、三、四周處死大鼠，收集血清，檢測肝功指標，觀察肝臟恢復情況。 實驗結果: 1、成功培養(yǎng)出了BMSCs，并

5、獲得較為純化的細胞；描繪出了BMSCs生長曲線圖；檢測了BMSCs的表面標記物CD29和CD44，陽性細胞數(shù)分別為9.75×10<'4>/ml和9.5×10<'4>/ml，陽性率分別為97.5％和95％。 2、建立了大鼠肝硬化模型。 3、血清學檢測法檢測了BMSCs輸注后肝功的改變。 結論: 1、可以通過體外全骨髓培養(yǎng)法獲得純化的BMSCs，同時證明了BMSCs具有旺盛的增殖能力。CD29和CD44可以在