骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞體內(nèi)移植治療肝硬化的初步實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：肝硬化是肝臟發(fā)生的慢性、進(jìn)行性改變。病理上以肝組織彌漫性纖維化、假小葉和再生結(jié)節(jié)形成為特征，臨床表現(xiàn)為肝功損害和門(mén)脈高壓。肝硬化是我國(guó)常見(jiàn)疾病和主要死亡病因之一。目前，臨床上針對(duì)肝硬化的各種治療方法均存在某些弊端，尚無(wú)安全有效的最佳療法。近年來(lái)，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)因其具有多向分化潛能而成為備受關(guān)注的種子細(xì)胞。鑒于此，本實(shí)驗(yàn)以體外分離培養(yǎng)BMSCs并建立肝硬化動(dòng)物模型為基礎(chǔ)，通過(guò)體內(nèi)直接輸注BMSCs來(lái)檢測(cè)其是否可以改善

2、受損肝臟的肝功能，為BMSCs臨床治療肝硬化的可行性提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 實(shí)驗(yàn)方法: 一、BMSCs的分離純化及表面標(biāo)志物的檢測(cè) 1、BMSCs的分離純化選取四周齡100-120g健康雄性SD大鼠，獲取BMSCs，在37℃、5％CO<,2>條件下，用含10％胎牛血清的L-DMEM培養(yǎng)液進(jìn)行貼壁培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞達(dá)到80％-90％融合時(shí)，以1∶2的比例進(jìn)行傳代培養(yǎng)，三代后獲取較為純化的BMSCs。 2、BMSCs的生長(zhǎng)

3、曲線測(cè)定取生長(zhǎng)良好的1代和3代細(xì)胞，消化后以1×10<'4>/ml的密度接種于24孔板內(nèi)。此后，每天取三孔計(jì)數(shù)，并計(jì)算均值，連續(xù)9天。據(jù)此繪出BMSCs的生長(zhǎng)曲線。 3、BMSCs表面標(biāo)記物的測(cè)定取3代較為純化BMSCs細(xì)胞，應(yīng)用免疫熒光法檢測(cè)BMSCs表面標(biāo)記物CD29、CD44的陽(yáng)性表達(dá)并計(jì)算其陽(yáng)性率。 二、大鼠肝硬化模型的建立健康雌性SD大鼠80只，體重150-180g，飼養(yǎng)一周后隨機(jī)分為三組：正常組(20只)，普

4、食普水；實(shí)驗(yàn)對(duì)照組(30只)和實(shí)驗(yàn)組(30只)均皮下注射40％四氯化碳和60％植物油混合液，0.3ml/kg體重，每周兩次，連續(xù)注射八周，實(shí)驗(yàn)期間給予正常飲食。八周后取正常組、實(shí)驗(yàn)組和實(shí)驗(yàn)對(duì)照組大鼠肝臟作病理切片觀察肝臟改變情況。 三、BMSCs輸注后肝功測(cè)定向?qū)嶒?yàn)組大鼠體內(nèi)輸注純化的BMSCs，分別于一、二、三、四周處死大鼠，收集血清，檢測(cè)肝功指標(biāo)，觀察肝臟恢復(fù)情況。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果: 1、成功培養(yǎng)出了BMSCs，并

5、獲得較為純化的細(xì)胞；描繪出了BMSCs生長(zhǎng)曲線圖；檢測(cè)了BMSCs的表面標(biāo)記物CD29和CD44，陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)分別為9.75×10<'4>/ml和9.5×10<'4>/ml，陽(yáng)性率分別為97.5％和95％。 2、建立了大鼠肝硬化模型。 3、血清學(xué)檢測(cè)法檢測(cè)了BMSCs輸注后肝功的改變。 結(jié)論: 1、可以通過(guò)體外全骨髓培養(yǎng)法獲得純化的BMSCs，同時(shí)證明了BMSCs具有旺盛的增殖能力。CD29和CD44可以在