骨髓間充質(zhì)干細胞的體外培養(yǎng)及體內(nèi)移植實驗性研究.pdf

1、病毒性肝炎是一種嚴重威脅人類健康的常見病，特別是乙型肝炎病毒(HBV)所引起的乙型病毒性肝炎，全球約有3億以上慢性病毒性肝炎及其病毒攜帶者，而我國是一個病毒性肝炎大國，約有1.2億慢性病毒性肝炎感染者。由于各種原因所引起的病毒反復活動破壞肝實質(zhì)細胞，可引起肝細胞的變性、壞死，纖維組織增生和肝細胞結(jié)節(jié)狀再生，從而進一步發(fā)展為肝硬化甚至肝癌，已成為威脅肝病患者生命的主要原因。目前原位肝移植(OLT)是治療各種肝功能失代償期、肝功能衰竭期最有

2、效的治療方法，但因為肝源缺乏、費用昂貴、以及移植后的并發(fā)癥等限制了OLT的廣泛應用。
　　 近年來，新的干預性治療不斷出現(xiàn)，通過進行干細胞移植，利用外源性的具有高度增殖活性和多向分化能力的干細胞移植來達到損傷組織或細胞的修復與再生的目的。間充質(zhì)來源的成體干細胞稱間充質(zhì)干細胞(MSC)，其概念最初是由Friedenstein和同事于20世紀70年代提出的，F(xiàn)riedenstein和同事在培養(yǎng)骨髓細胞時發(fā)現(xiàn)一種與成纖維細胞形態(tài)相似，

3、貼壁生長的梭形細胞，有集落形成能力，在體內(nèi)和體外均可分化為成骨細胞、成軟骨細胞與基質(zhì)細胞。目前證實間充質(zhì)干細胞存在于機體的多種組織中，包括臍帶、臍帶血、骨髓、脂肪、外周血、骨骼肌等。骨髓間充質(zhì)干細胞(BMSCs)是指來源于骨髓的間充質(zhì)干細胞，是間充質(zhì)干細胞所有種類中來源最豐富和應用最廣泛的一種細胞。體外大量研究證實了骨髓間充質(zhì)干細胞有著高度的自我更新能力和較強的多胚層分化潛能，在特定因素誘導下可以分化為骨細胞、軟骨細胞、骨骼肌細胞、脂肪

4、細胞、內(nèi)皮細胞、心肌細胞、星形膠質(zhì)細胞、神經(jīng)細胞和肝細胞。
　　 大量動物實驗及臨床研究表明，骨髓來源間充質(zhì)干細胞移植用于治療肝臟相關性疾病中可獲得以下效果:先天性肝臟代謝缺陷疾病的糾正，可改善肝性腦病癥狀，暫時性替代部分肝細胞和肝臟組織的功能，提高血清白蛋白水平，降低血清轉(zhuǎn)氨酶、血氨及總膽紅素水平。隨著干細胞研究的深入，BMSCs移植在不久的將來會成為臨床肝臟疾病治療的常規(guī)手段。
　　 目的:
　　 1、探索體

5、外分離純化、凍存大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞( Bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)的最適方法，探討體外培養(yǎng)BMSCs是否具有成瘤性，為其成為組織工程與臨床康復理想的種子細胞提供實驗依據(jù)。
　　 2、探索不同途徑移植GFP標記的大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞(BMSCs)在慢性肝纖維化的作用，以及移植后細胞在肝臟組織內(nèi)存活、分布情況，為臨床BMSCs應用提供理論基礎。
　　 方法:
　　

6、 1、購清潔級別SD雄性大鼠，6只，1月齡，利用沖洗骨髓腔的方法所獲得大鼠BMSCs，加入含10％胎牛血清的低糖DMEM培養(yǎng)基，吹打混勻后給予相應的處理。A組給予1.5h棄貼壁細胞，24h首次換液后繼續(xù)培養(yǎng);B組24h首次換液后繼續(xù)培養(yǎng);C組48h首次換液后培養(yǎng)。顯微鏡下觀察細胞貼壁情況及形態(tài)學變化。
　　 2、待P3細胞長至80％—85％匯合，消化細胞后向沉淀物中加入血清濃度分別為10％、20％、30％、40％、50％的細胞

7、冷凍液，輕輕吹打混勻，使細胞密度達1×106個/mL后置于梯度凍存盒，-80℃冰箱短期保存。1月后行凍存細胞復蘇。輕輕吹吸混勻后分為三組，A組細胞復蘇后行臺盼藍染色，計算細胞存活率;B組細胞懸液接種到96孔板培養(yǎng)，分別在接種后第1到8天每天取3個孔，行活細胞計數(shù)后繪制出細胞生長曲線;C組成脂誘導培養(yǎng)D21天后行油紅O染色，觀察復蘇后細胞成脂能力。
　　 3、購SPF級裸鼠，6只，1月齡，實驗組將P3、P15代大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞

8、行免疫組織化學染色和成脂誘導鑒定后，分別通過裸鼠后肢股四頭肌肌肉、肝臟組織局部注射體內(nèi)移植，對照組以生理鹽水局部注射至相應部位。觀察裸鼠生存狀態(tài)及接種部位有無新生物形成，45天后行注射部位病理組織標本HE染色檢查觀察有無異型細胞生長。
　　 4、購清潔級SD雄性大鼠，15只，300±50g，將苯巴比妥鈉注射液350mg/L混于純水中供大鼠飲用，7天后按每100g0.125ml/四氯化碳橄欖油混合液(2∶3)給予大鼠灌胃，2次/周

9、，持續(xù)8周。8周后將存活下來的肝硬化模型大鼠行肝功能檢測，根據(jù)檢測結(jié)果將成功造模的肝硬化大鼠隨機分為尾靜脈移植組、肝臟局部注射組、肝動脈注射組、肝門靜脈注射組和肝硬化未移植組。
　　 5、購清潔級SD雄性大鼠，2只，1月齡，利用全骨髓差速貼壁法分離、培養(yǎng)骨髓間充質(zhì)干細胞，取第三代骨髓間充質(zhì)干細胞，一部分用于CD34、CD44免疫組織化學染色和成脂誘導鑒定，一部分利用攜帶EGFP基因的慢病毒載體感染標記骨髓間充質(zhì)干細胞。
　

10、　 6、通過尾靜脈、肝臟局部注射、肝動脈注射、肝門靜脈四種注射途徑將標記好的BMSCs移植到肝硬化模型大鼠體內(nèi)，移植后維持四氯化碳肝損傷，1月后處死大鼠檢測血清白蛋白、谷丙轉(zhuǎn)氨酶、谷草轉(zhuǎn)氨酶指標;取肝臟組織行HE染色和天狼星紅-苦味酸染色觀察肝硬化程度;取肝臟組織白片在熒光顯微鏡下觀察切片組織熒光分布情況。
　　 結(jié)果:
　　 1、A組可見大量骨髓間充質(zhì)干細胞貼壁生長，多為短梭形和不規(guī)則三角形，核橢圓形，較大，有的可見

11、雙核， B組、C組除了可見短梭形細胞外，還可見較大的圓形細胞及長梭形細胞貼壁，細胞組成形態(tài)較A組復雜。
　　 2、凍存與復蘇對骨髓間充質(zhì)干細胞的存活和增殖能力存在一定的影響，細胞生長潛伏期延長，隨著血清濃度的遞減這種影響也愈加明顯;接種密度偏高利于細胞復蘇后生長與增殖，含30％血清組接種密度過低，細胞生長速度較其他各組慢，但待細胞增殖到某一數(shù)量后細胞增殖速度明顯加快。
　　 3、BMSCs傳至15代仍保持間充質(zhì)干細胞特性

12、，BMSCs移植入裸鼠肝臟45天后可在局部肝臟存活，生長狀態(tài)與體外培養(yǎng)相似，無異型性及向周圍浸潤生長。
　　 4、全骨髓差速貼壁法24h后給予全量換液去除未貼壁細胞后，可見散在貼壁細胞，形態(tài)較為均一，成短梭形或星形。隨著培養(yǎng)天數(shù)的增長，逐漸出現(xiàn)放射狀排列的細胞集落。7-12天細胞增殖旺盛，集落逐漸融合，排列緊密并成旋渦狀。P3代細胞免疫組織化學染色CD34-，CD44+，成脂誘導油紅O染色(+)，具有骨髓間充質(zhì)干細胞的生物學特性

13、。
　　 5、肝功能檢測提示苯巴比妥聯(lián)合四氯化碳誘導大鼠慢性肝纖維化損傷持續(xù)8周（移植前）各組白蛋白( Alb)水平均較正常大鼠低，谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)活性均較正常大鼠高，移植后各組Alb持續(xù)性下降，谷丙轉(zhuǎn)氨酶和谷草轉(zhuǎn)氨酶水平因肝損傷刺激的減少也逐漸下降，且各組下降幅度相當。
　　 6、不同途徑大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞移植后肝臟組織病理組織切片HE染色示正常肝小葉結(jié)構(gòu)破壞，肝細胞排列紊亂，可見大量肝細胞

14、空泡變性，門管區(qū)有廣泛的膠原纖維增生，向小葉內(nèi)伸展，形成假小葉。天狼猩紅-苦味酸染色示骨髓間充質(zhì)干細胞移植組和對照生理鹽水注射組在肝門靜脈區(qū)和肝實質(zhì)內(nèi)均有大量紅染膠原纖維沉積，形成假小葉。
　　 7、經(jīng)GFP標記的骨髓間充質(zhì)干細胞與P3代骨髓間充質(zhì)干細胞形態(tài)類似，隨著體外培養(yǎng)時間的延長，細胞的綠色熒光逐漸減退，變成黃綠色甚至黃色。移植后四周肝臟局部組織切片免疫熒光顯微鏡下觀察示:尾靜脈移植組在門管區(qū)纖維間隔內(nèi)可見大量表達黃色熒光

15、信號的細胞，局部注射組、肝動脈組、門靜脈組亦分別在局部注射部位、小葉間動脈、小葉間靜脈（中央靜脈）等部位見到黃色熒光表達，且均分布在膠原纖維含量較多的部位。
　　 結(jié)論:
　　 1、本實驗首次利用1.5h差速貼壁結(jié)合24h首次全量換液法，在原代即可獲得形態(tài)均一、增殖速度快、性狀穩(wěn)定的BMSCs，且具有操作簡單、快捷、實用、對細胞損傷小等優(yōu)點，為其作為組織工程種子細胞提供了實驗基礎。
　　 2、含30％濃度的血清凍

16、存液凍存骨髓間充質(zhì)干細胞，既可最大化的保證骨髓間充質(zhì)干細胞活性及增殖能力，又可保證其遺傳特性和多分化的能力。
　　 3、體外長時間培養(yǎng)BMSCs在15代以內(nèi)移植入裸鼠體內(nèi)可以在局部肝臟內(nèi)存活，且沒有成瘤性，隨著體外培養(yǎng)傳代次數(shù)的增多其具有成瘤性的風險增加。
　　 4、免疫熒光顯微鏡下觀察表達熒光信號的細胞在肝小葉內(nèi)的分布不同，考慮可能與細胞移植途徑有關，但均分布在肝小葉匯管區(qū)或小葉血管周圍膠原纖維沉積較多的部位。