肝移植骨髓間充質干細胞的體內外實驗研究.pdf

1、背景：
　　對于各種原因引起的終末期肝病，目前肝移植仍是唯一確切有效的治療方法。但是肝源的缺乏、高昂的手術和術后治療費用以及各種術后并發(fā)癥限制了肝移植的廣泛開展。而肝臟干細胞移植為終末期肝病的治療提供了新的途徑，其中骨髓間充質干細胞(Bone marrow mensenchymal stem cells，BMSCs)因其易分離擴增、增殖分化潛能強、可自體取材等優(yōu)點，目前受到科研和臨床上的廣泛關注。但是移植BMSCs治療肝臟疾病仍存

2、在諸多爭議:(1)如何通過簡便易行的分離培養(yǎng)方法獲得活力好、純度高的BMSCs;(2)大多數(shù)終末期肝病均伴隨不同程度的門靜脈高壓，在門靜脈高壓這一特殊的血流動力學狀態(tài)下，移植的BMSCs能否順利遷移并定植于肝臟;(3)影響B(tài)MSCs向肝內遷移定植的因子有哪些;(4)除分化為肝系細胞并替代其功能外，BMSCs會對肝細胞的存活和功能狀態(tài)產(chǎn)生何種影響。
　　目的：
　　1.探討體外分離、培養(yǎng)、純化BMSCs的可行性，觀察體外誘導的

3、BMSCs能否向肝系細胞分化。
　　2.比較經(jīng)脾移植的BMSCs在正常大鼠和門靜脈高壓大鼠肝內的分布情況。
　　3.初步探討影響B(tài)MSCs向肝臟遷移定植的因素。
　　4.評估在體外不同共培養(yǎng)條件下BMSCs對肝細胞存活和功能的影響。
　　方法：
　　1.Sprague-Dawley(SD)大鼠全骨髓細胞差速貼壁培養(yǎng)法分離、純化、擴增BMSCs，光鏡下觀察細胞生長及增殖情況，流式細胞術檢測第5代BMSCs表面

4、CD29、CD90及CD34的陽性率。肝細胞生長因子（Hepatocyte growth factor, HGF）和成纖維細胞生長因子-4（Fibroblast growth factor-4，F(xiàn)GF-4）聯(lián)合誘導第5代BMSCs向肝系細胞分化，光鏡及電鏡下觀察分化細胞微觀結構及超微結構的變化，免疫熒光法檢測分化細胞甲胎蛋白(Alpha fetal protein，AFP)、細胞角蛋白18(Cytokeratin18，CK-18)和白蛋

5、白（Albumin，ALB）的表達情況。
　　2.受體大鼠隨機分為實驗組和對照組。實驗組大鼠行膽總管結扎術，對照組大鼠實施假手術，術后飼養(yǎng)2周，經(jīng)脾移植CM-Dil熒光標記的BMSCs分化細胞懸液，繼續(xù)飼養(yǎng)1周后，測定大鼠門靜脈壓力同時檢測肝功能。取肝組織制作石蠟切片，熒光顯微鏡下觀察肝組織內移植細胞的分布情況并拍照，應用圖像分析軟件計算各視野紅色熒光的積分光密度值（Integral optical density, IOD），并

6、分析其與門靜脈壓力關系。
　　3.取實驗組（膽總管結扎2周）和對照組大鼠肝臟組織，運用大鼠的全基因組表達譜芯片技術對實驗組大鼠和對照組大鼠肝臟的基因表達情況進行比較。芯片篩查出差異表達的基因，結合文獻報道和美國國立生物技術信息中心(NCBI)網(wǎng)站提供的Genebank中的基因功能，篩選可能與BMSCs遷移及粘附定植相關的基因。通過Real-time PCR和Western Blot技術在RNA和蛋白水平進行驗證。初步篩選出可能與B

7、MSCs向肝臟遷移定植相關的因子。
　　4.灌注并消化人肝臟組織碎片，分離獲得游離肝細胞，分別將肝細胞體外獨立培養(yǎng)（Mono-culture，Mono組）、與常氧預處理的BMSCs間接共培養(yǎng)(Indirectco-culture with Normoxia preconditioned BMSCs，I-N組)、與缺氧預處理的BMSCs間接共培養(yǎng)（Indirect co-culture with Hypoxia preconditi

8、oned BMSCs，I-H組），與常氧預處理的BMSCs直接共培養(yǎng)（Direct co-culture with Normoxia preconditionedBMSCs，D-N組）、與缺氧預處理的BMSCs直接共培養(yǎng)（Direct co-culture withHypoxia preconditioned BMSCs，D-H組）。共培養(yǎng)第1、4、7天MTT法檢測肝細胞的存活情況，同時測定上清液中ALB的含量評估肝細胞功能。
　

9、　結果：
　　1.全骨髓細胞培養(yǎng)24小時后可見BMSCs貼壁生長并逐漸分裂增殖。隨著連續(xù)傳代，BMSCs純度逐漸提高。細胞形態(tài)由原代細胞的不規(guī)則形或多邊形逐漸轉變?yōu)榫坏募忓N形。流式細胞儀檢測第5代BMSCs CD29和CD90陽性率均達96％以上。第5代BMSCs經(jīng)HGF、FGF-4聯(lián)合誘導2周后AFP、CK18和ALB表達均呈陽性。光學顯微鏡下顯示經(jīng)HGF、FGF-4誘導的第5代BMSCs逐漸趨于立方形，呈網(wǎng)格狀鑲嵌排列。電子

10、顯微鏡顯示未經(jīng)誘導的第1代和第5代BMSCs內細胞器種類及數(shù)量無明顯差別，而經(jīng)過誘導的第5代BMSCs分化細胞內高爾基體、內質網(wǎng)、核糖體、線粒體等細胞器均明顯增多。
　　2.CM-Dil標記BMSCs的分化細胞后可使細胞膜呈現(xiàn)紅色熒光，標記率高達95.5％。CM-Dil對細胞貼壁、生長及增殖無明顯影響。膽總管結扎的大鼠飼養(yǎng)2周后，逐漸出現(xiàn)梗阻性黃疸、白陶土樣便、深黃色尿。飼養(yǎng)3周后檢測肝功能顯示實驗組總膽紅素(Total bili

11、mbin，TB)、直接膽紅素(Direct bilirubin，DB)、谷丙轉氨酶（Alanine aminotransaminase，ALT）、谷草轉氨酶（Aspartateaminotransferase，AST）均較對照組明顯升高（TB:121.9±19.2 vs.8.7±4.2mmol/1;DB:116.9.9±19.4 vs.4.9±2.3mmol/1; ALT:105.9±72.7 vs.21.9±6.9u/1; AST:3

12、98.0±209.6 vs.22.1±9.0u/1，P＜0.01），血清ALB較對照組明顯降低（22.4±6.9 vs.32.2±3.7g/1，P＜0.05）。實驗組大鼠肝門部均形成0.5-1cm囊腫，肝臟明顯腫大變硬，表面布滿細小結節(jié)。實驗組大鼠門靜脈壓力明顯高于對照組（18.04±2.35 vs.9.75±1.40cmH2O，P＜0.01），提示形成了梗阻性黃疸伴門脈高壓的動物模型。肝臟病理紅色熒光IOD值實驗組明顯高于對照組(11

13、30067±209464 vs.293505±88383/Hpf, P＜0.01)。
　　3.經(jīng)全基因組表達譜芯片篩查，與細胞遷移相關的四個基因CX3CL1、CXCR4、MLLT4和PDGFA在實驗組肝臟組織中表達明顯上調。Real-time PCR檢測兩組肝臟組織中CX3CL1、CXCR4、MLLT4和PDGFA在RNA水平的表達，結果發(fā)現(xiàn)，實驗組肝臟組織中CX3CL1(2-△△C=6.08)和CXCR4（2-△△C=2.00）

14、表達明顯高于對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)，而MLLT4（2-△△C=1.15）和PDGFA（2-△△C=1.32）表達略高于對照組，但差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。Westernblot檢測蛋白質表達發(fā)現(xiàn)，實驗組CX3CL1(0.64±0.08 vs.0.32±0.09)和CXCR4(0.63±0.15 vs.0.40±0.09)蛋白相對表達量明顯高于對照組(P＜0.05)。
　　4.I-N組和D-N組肝細胞存活率

15、在共培養(yǎng)第4天和第7天均明顯高于Mono組(P＜0.05)。I-N組與D-N組比較、I-H組與D-H組比較，肝細胞存活率在共培養(yǎng)第1、4、7天均無差異(P＞0.05)。I-H組和D-H組肝細胞存活率在共培養(yǎng)第4天分別明顯高于I-N組和D-N組(P＜0.05)，而在第1天和第7天無差異（P＞0.05）。共培養(yǎng)第1、4、7天培養(yǎng)液中ALB含量，I-N組與Mono組比較均無差異(P＞0.05)，D-N組僅在共培養(yǎng)第4天高于Mono組(P＜0.

16、05)。D-N組ALB含量在共培養(yǎng)第4天高于I-N組（P＜0.05），而D-H組在共培養(yǎng)第4、7天高于I-H組(P＜0.05)。I-N組和I-H組、D-N組和D-H組比較在共培養(yǎng)第1、4、7天ALB含量均無差異(P＞0.05)。
　　結論：
　　1.全骨髓細胞差速貼壁培養(yǎng)法可成功分離BMSCs，通過連續(xù)傳代可獲得純化。HGF和FGF-4可聯(lián)合誘導BMSCs分化為AFP、CK-18和ALB表達陽性的肝系細胞。經(jīng)誘導的BMSCs

17、分化細胞微觀結構和超微結構都發(fā)生明顯改變。
　　2.CM-Dil是細胞移植較為理想的標記示蹤材料。SD大鼠膽總管結扎2周后可出現(xiàn)明顯的黃疸癥狀，3周后形成典型的梗阻性黃疸伴門靜脈高壓的動物模型。膽汁性肝硬化致門靜脈壓力增高時，經(jīng)脾移植的BMSCs向肝內遷移增多，提示可能存在某些化學性因子趨化移植的細胞進入病變肝臟定植。
　　3.實驗組肝臟組織中CX3CL1和CXCR4在RNA水平和蛋白水平的表達均高于對照組，提示CX3CL1