骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞抑制自體移植靜脈內(nèi)膜增生的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、研究背景及目的：自體靜脈移植(autologous vein grafting，AVG)是治療冠狀動(dòng)脈及周圍動(dòng)脈缺血的重要方法。但是它的長期通暢率仍然受靜脈橋病變?nèi)鐒?dòng)脈硬化，斑塊形成的顯著影響。文獻(xiàn)報(bào)道靜脈移植術(shù)后的前兩年約有20％-40％的患者會(huì)出現(xiàn)橋血管腔狹窄，故預(yù)防靜脈移植后再狹窄及提高遠(yuǎn)期通暢率已成為當(dāng)今心血管病防治研究的一個(gè)重要方向。 研究表明靜脈移植后再狹窄的病理機(jī)制是以血管內(nèi)皮損傷作為始動(dòng)環(huán)節(jié)的，隨后是巨噬細(xì)胞的粘

2、附和浸潤，以及平滑肌細(xì)胞向內(nèi)膜遷移和過度增殖。盡管與冠狀動(dòng)脈粥樣硬化疾病和血管成形術(shù)后再狹窄在病因及流行病學(xué)上有所不同，但是靜脈橋移植后再狹窄和前兩者具有一個(gè)共同的病理生理學(xué)階段：即內(nèi)皮完整性被破壞和新生內(nèi)膜的形成(新生內(nèi)膜的主要成分是過度增生的平滑肌細(xì)胞)。因此如何保護(hù)血管內(nèi)皮或者早期恢復(fù)損傷的內(nèi)皮功能，成為目前研究的重點(diǎn)。 干細(xì)胞(stem cell)是當(dāng)今器官和組織修復(fù)研究的熱點(diǎn)，它是一類具有自我復(fù)制和分化潛能的未分化細(xì)胞

3、，在適宜的條件下，可以分化為不同類型的具有特征性形態(tài)、特異分子標(biāo)志和特殊功能的成熟細(xì)胞。近幾年的研究發(fā)現(xiàn)，成體中的干細(xì)胞具有可塑性，在特定的條件下可跨系統(tǒng)、跨胚層分化為其它組織的細(xì)胞，稱為橫向分化。成體干細(xì)胞中研究最廣泛的是骨髓中的造血干細(xì)胞和間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow-derived mesenchymal stem cells，BMSCs)。研究發(fā)現(xiàn)，BMSCs在體內(nèi)外不同的微環(huán)境中可以被誘導(dǎo)分化為多種細(xì)胞。由于BMSCs

4、具有易于分離培養(yǎng)和體外擴(kuò)增，并可自體移植無免疫排斥反應(yīng)的特點(diǎn)，因此利用BMSCs的橫向分化潛能，可以根據(jù)需要將其誘導(dǎo)分化為特定的組織細(xì)胞，用以修復(fù)受損的組織或器官。已有大量證據(jù)表明骨髓起源的前體細(xì)胞或者干細(xì)胞能促進(jìn)缺血組織的血管新生和梗死心肌的再生。 本研究的目的是通過將BMSCs經(jīng)血管移植到袖套管法建立的大鼠AVG模型中，觀察BMSCs移植后向向血管內(nèi)皮分化的情況，以及對(duì)靜脈橋血管新生內(nèi)膜形成的影響，探討B(tài)MSCs移植預(yù)防靜脈

5、橋移植物再狹窄的可行性。 方法：采用體重為100g左右的雄性Wistar大鼠用于分離和獲取BMSCs。首先通過貼壁培養(yǎng)法從供體大鼠骨髓中分離BMSCs，用含10％胎牛血清的低糖DMEM培養(yǎng)基擴(kuò)增培養(yǎng)3代；觀察不同培養(yǎng)時(shí)間的細(xì)胞形態(tài)，并用流式細(xì)胞儀檢測表達(dá)CD90、CD44、CD34、CD45的陽性細(xì)胞數(shù)，以鑒定BMSCs的表型。然后經(jīng)促進(jìn)內(nèi)皮生長分化的細(xì)胞因子聯(lián)合誘導(dǎo)，體外觀察BMSCs向內(nèi)皮方向的分化。移植前用二氨基苯基吲哚(

6、DAPI)標(biāo)記細(xì)胞。 采用體重250-300g雄性Wistar大鼠作為AVG模型動(dòng)物。將AVG模型動(dòng)物分為三組(每組各26只)：正常對(duì)照組、AVG模型組和BMSCs移植組。取大鼠左側(cè)頸外靜脈2cm上下倒置后用袖套管法將其移植到同側(cè)的頸總動(dòng)脈，制作AVG動(dòng)物模型。AVG術(shù)后立即將標(biāo)記的BMSCs通過尾靜脈注射移植到體內(nèi)。分別于移植后的2w和4w取靜脈移植物，通過CD31和內(nèi)皮型一氧化氮合酶(eNOS)免疫熒光染色來觀察移植細(xì)胞的存

7、活以及分化為內(nèi)皮細(xì)胞的情況；通過Real-time PCR和western blot分析eNOS和誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(iNOS)的表達(dá)，來檢測內(nèi)皮功能的恢復(fù)情況；并進(jìn)行增殖細(xì)胞核抗原(PCNA)免疫組織化學(xué)染色及HE染色觀察移植后新生內(nèi)膜增生情況，計(jì)算新生內(nèi)膜、平滑肌層的厚度。分析各組之間各項(xiàng)指標(biāo)的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。 結(jié)論：利用袖套管法建立大鼠頸外靜脈到頸總動(dòng)脈的移植模型，手術(shù)簡便易行，成功率高，死亡率低。BMSCs在體外經(jīng)多種促內(nèi)皮

8、生長分化的細(xì)胞因子聯(lián)合誘導(dǎo)可分化為內(nèi)皮細(xì)胞；BMSCs的移植可以促進(jìn)AVG術(shù)后移植靜脈橋血管的早期再內(nèi)皮化，改善內(nèi)皮細(xì)胞的功能，抑制內(nèi)膜的過度增生。因此BMSCs移植可能成為防治AVG術(shù)后早期再狹窄的一個(gè)新的治療手段。 目的：探討骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow-derived mesenchymal stem cells，BMSCs)的提取、分離培養(yǎng)和體外擴(kuò)增的最佳條件，觀察在體外培養(yǎng)BMSCs向內(nèi)皮分化的能力，為進(jìn)一

9、步促進(jìn)自體移植血管橋內(nèi)皮細(xì)胞的損傷修復(fù)研究提供理想的移植供體細(xì)胞。 方法：通過貼壁培養(yǎng)法從成年大鼠骨髓中分離BMSCs，用含10％胎牛血清的低糖DMEM培養(yǎng)擴(kuò)增；觀察不同培養(yǎng)時(shí)間的細(xì)胞形態(tài)，并通過流式細(xì)胞儀和免疫熒光染色檢測BMSCs的表型抗原。經(jīng)促內(nèi)皮生長分化的細(xì)胞因子聯(lián)合誘導(dǎo)，體外觀察BMSCs向內(nèi)皮方向分化的潛能。 結(jié)論：用貼壁培養(yǎng)法可以對(duì)BMSCs進(jìn)行分離培養(yǎng)和傳代擴(kuò)增。在細(xì)胞因子誘導(dǎo)下，BMSCs可向內(nèi)皮細(xì)胞方

10、向分化。提示BMSCs是修復(fù)血管內(nèi)皮細(xì)胞理想的移植供體細(xì)胞。 目的：自體靜脈移植(autologous vein grafting，AVG)是治療冠狀動(dòng)脈及周圍動(dòng)脈缺血的重要方法，但移植后的內(nèi)膜增生所致的再狹窄嚴(yán)重地影響了遠(yuǎn)期的療效。本研究擬將骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow-derived mesenchymalstem cells，BMSCs)移植到AVG大鼠模型中，觀察BMSCs在血管橋中向內(nèi)皮細(xì)胞分化的能力及對(duì)血

11、管橋新生內(nèi)膜形成的抑制作用，從而探討B(tài)MSCs移植預(yù)防AVG血管橋再狹窄的可行性。 方法：通過貼壁培養(yǎng)法從成年大鼠骨髓中分離純化BMSCs，移植前用DAPI標(biāo)記細(xì)胞。將左側(cè)頸外靜脈2cm上下倒置后用袖套管法移植到同側(cè)的頸總動(dòng)脈制作AVG動(dòng)物模型。BMSCs移植組即術(shù)后立即將標(biāo)記的細(xì)胞通過尾靜脈注射移植到體內(nèi)。按照上述方法將動(dòng)物分為三組(每組26只)：(1)正常對(duì)照組，受體大鼠不進(jìn)行自體靜脈移植和BMSCs移植。(2)AVG模型組

12、，受體大鼠只進(jìn)行自體靜脈移植手術(shù)，術(shù)后不進(jìn)行BMSCs移植。(3)BMSCs移植組，在進(jìn)行自體靜脈移植后又進(jìn)行BMSCs移植術(shù)。術(shù)后每組分兩批，分別于2w(14只)和4w(12只)處死，取出移植靜脈橋以備檢測。通過組織冰凍切片，進(jìn)行CD31和內(nèi)皮型一氧化氮合酶(eNOS)的免疫熒光染色，觀察移植細(xì)胞的存活、分化情況。通過Real-time PCR和western blot檢測移植靜脈中eNOS和誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(iNOS)的表達(dá)，分析