兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞自體移植治療睪丸源性不育的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、第一部分，高能電子射線局部照射兔陰囊制作睪丸源性不育動(dòng)物模型的研究
　　 目的:
　　 探討應(yīng)用高能電子射線單次局部照射成年雄性新西蘭大耳白兔陰囊方法，以建立適宜進(jìn)行自體骨髓干細(xì)胞睪丸內(nèi)移植研究的動(dòng)物模型。
　　 方法:
　　 5月齡健康雄性新西蘭大耳白兔30只，隨機(jī)分為5組，每組6只。A、B、C、D為實(shí)驗(yàn)組，E組為對(duì)照組。實(shí)驗(yàn)組兔在麻醉狀態(tài)下利用直線加速器產(chǎn)生的電子射線單次局部照射陰囊，照射劑量各組分別

2、為6、8、10、12Gy;對(duì)照組兔在麻醉下置于操作臺(tái)5min，不進(jìn)行照射。處理后觀察各組兔的存活、精神活力、進(jìn)食、二便性狀等一般情況;2、4周后抽兔耳緣靜脈血行血常規(guī)檢查，麻醉下取一側(cè)脛骨骨髓行骨髓象檢查，分別比較白細(xì)胞、血紅蛋白、血小板數(shù)量改變，觀察骨髓增生程度改變;2、4、6、8、12周后每組每次切除1只兔的雙側(cè)睪丸行大體觀察，睪丸組織切片HE染色，觀察生精上皮的結(jié)構(gòu)變化，計(jì)算生精小管的中空率，每個(gè)睪丸的全部切片中至少取400個(gè)生精

3、小管斷面計(jì)算無各級(jí)精子發(fā)生生精小管所占的百分比），并進(jìn)行比較。
　　 結(jié)果:
　　 一般情況:所有兔均全部存活。實(shí)驗(yàn)組兔精神狀態(tài)、進(jìn)食與對(duì)照組相比，無明顯變化，均未出現(xiàn)血尿、血便、腹瀉。
　　 血常規(guī)及骨髓象檢查:2周及4周后，A、B、C、D組與E組相比，白細(xì)胞、血紅蛋白、血小板數(shù)量均無顯著性差異(p＞0.05)。2、4周時(shí)，各組骨髓象均增生活躍，粒紅比例與正常組相比無明顯區(qū)別。
　　 睪丸組織病理學(xué)結(jié)果

4、:正常對(duì)照組各級(jí)生精細(xì)胞排列有序，內(nèi)含精子，中空率始終為0。在相同時(shí)間段內(nèi)，各實(shí)驗(yàn)組生精上皮顯示不同程度損傷，支持細(xì)胞、間質(zhì)細(xì)胞均可見，未見明顯損傷;隨放射劑量增加，曲細(xì)精管中空率增加。隨時(shí)間延長，A、B組中空率逐漸降低，并逐漸恢復(fù);C、D組中空率則表現(xiàn)為逐漸增高的趨勢(shì)。在6、8、12周時(shí)，C、D組中空率組內(nèi)比較無明顯差異;組間比較，差異顯著(p＜0.05)。D組在6周后中空率基本穩(wěn)定在90％以上。
　　 結(jié)論:
　　

5、1、12Gy劑量以下電子射線單次陰囊局部放射，無明顯的全身不良反應(yīng)。
　　 2、12Gy劑量以下電子射線單次局部照射雄性新西蘭大耳白兔陰囊，可使生精上皮不同程度凋亡甚至消失，支持細(xì)胞及間質(zhì)細(xì)胞不受影響。低劑量射線照射陰囊后，睪丸生精上皮隨時(shí)間延長，逐漸恢復(fù);高劑量射線作用下，睪丸生精功能受損持續(xù)存在。
　　 3、麻醉狀態(tài)下，以12Gy的電子射線、一次性局部照射5月齡雄性新西蘭大耳白兔陰囊6周后，可作為不育受體動(dòng)物模型，接

6、受干細(xì)胞睪丸移植實(shí)驗(yàn)。
　　 第二部分，兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向精原干細(xì)胞方向誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化的實(shí)驗(yàn)研究
　　 目的:
　　 確定兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BM-MSCs)體外分離、培養(yǎng)、擴(kuò)增、誘導(dǎo)、鑒定和標(biāo)定方法，觀察陰囊局部放射對(duì)BM-MSCs生長特性是否存在影響、BM-MSCs經(jīng)誘導(dǎo)后能否向SSCs方向轉(zhuǎn)化，為用于自體睪丸內(nèi)移植提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
　　 方法:
　　 應(yīng)用第一部分實(shí)驗(yàn)中D組及E組2周后的雄性新西蘭

7、大耳白兔，脛骨平臺(tái)處穿刺抽取骨髓。采用密度梯度離心法結(jié)合貼壁培養(yǎng)法獲取骨髓單個(gè)核細(xì)胞，體外連續(xù)培養(yǎng)、擴(kuò)增，通過形態(tài)學(xué)及免疫細(xì)胞化學(xué)法（測(cè)定CD34、CD44）鑒定分離培養(yǎng)的細(xì)胞是否為MSCs。選擇P3代細(xì)胞用精原干細(xì)胞(SSCs)條件培養(yǎng)液誘導(dǎo)培養(yǎng)，免疫組化法染色觀察CD117表達(dá)，判斷MSCs是否向精原干細(xì)胞方向轉(zhuǎn)化。BrdU標(biāo)記誘導(dǎo)前后的BM-MSCs，免疫組化法觀察比較BrdU的標(biāo)記陽性率。并通過觀察間充質(zhì)干細(xì)胞生長特性及描繪細(xì)胞

8、生長曲線，進(jìn)一步確定陰囊局部放射對(duì)骨髓干細(xì)胞生長的影響。最后，RT-PCR測(cè)定部分與生殖干細(xì)胞相關(guān)的基因Dazl、Oct-4、c-kit在BM-MSCs誘導(dǎo)前后的表達(dá)改變。
　　 結(jié)果:
　　 分離培養(yǎng)的BM-MSCs貼壁生長，呈纖維狀，細(xì)胞增殖能力強(qiáng)，原代細(xì)胞呈集落生長，10-12天逐漸融合，傳代后增殖速度加快。照射組與對(duì)照組兔骨髓干細(xì)胞形態(tài)無明顯區(qū)別，生長曲線一致。經(jīng)復(fù)合誘導(dǎo)培養(yǎng)基培養(yǎng)后細(xì)胞體積增大，仍呈梭形，有粗大

9、突起伸出，部分細(xì)胞呈三角形或多角形。細(xì)胞呈現(xiàn)典型的集落狀生長，集落大小不等。集落中可見較多的細(xì)胞分裂相，細(xì)胞大小不一。經(jīng)免疫細(xì)胞化學(xué)法鑒定，未經(jīng)誘導(dǎo)骨髓干細(xì)胞CD44陽性、CD34陰性，證實(shí)為間充質(zhì)干細(xì)胞;誘導(dǎo)后CD29、CD117陽性;RT-PCR測(cè)定誘導(dǎo)后干細(xì)胞Oct-4、Dazl、c-kit的表達(dá)增強(qiáng)。以50μmol/L終濃度BrdU標(biāo)記誘導(dǎo)前后的BM-MSCs，共培養(yǎng)72h，其標(biāo)記率均在80％以上，兩組比較無明顯差異。
　

10、　 結(jié)論:
　　 1、12Gy單次局部照射兔睪丸對(duì)提取骨髓培養(yǎng)MSCs無明顯影響，說明局部照射法制作的不育兔模型可用自體BM-MSCs進(jìn)行睪丸移植研究。
　　 2、骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞經(jīng)誘導(dǎo)液培養(yǎng)，存在向類似精原干細(xì)胞方向轉(zhuǎn)化的趨勢(shì)。
　　 3、以50μmol/L終濃度BrdU，與誘導(dǎo)后的BM-MSCs共培養(yǎng)72h，可較好的標(biāo)記BM-MSCs，用于后期睪丸移植示蹤。
　　 第三部分，兔自體骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞睪

11、丸移植重建生精功能的實(shí)驗(yàn)研究
　　 目的:
　　 將誘導(dǎo)后的自體BM-MSCs睪丸網(wǎng)移植后，通過觀察BM-MSCs的存活、遷移情況及生精上皮的組織結(jié)構(gòu)恢復(fù)及移植前后基因表達(dá)改變，探討B(tài)M-MSCs作為“種子細(xì)胞”改善睪丸性不育的效果。
　　 方法:
　　 5月齡健康雄性新西蘭大耳白兔20只，隨機(jī)分為4組（正常對(duì)照組、空白對(duì)照組、陰性對(duì)照組、移植實(shí)驗(yàn)組），每組5只。正常對(duì)照組5只，假照射;其余3組在麻醉狀態(tài)

12、下，按第一部分實(shí)驗(yàn)確定的方法制作睪丸性不育兔模型。2w后抽取移植實(shí)驗(yàn)組兔骨髓，分離、培養(yǎng)、擴(kuò)增BM-MSCs，取P3代在精原干細(xì)胞培養(yǎng)條件下誘導(dǎo)5d。將誘導(dǎo)后的BM-MSCs（濃度1×107）經(jīng)BrdU標(biāo)記后，經(jīng)兔睪丸網(wǎng)注射0.2ml。陰性對(duì)照組經(jīng)睪丸網(wǎng)移植誘導(dǎo)培養(yǎng)液0.2ml。移植完成后，分別在移植后2w、4w、6w時(shí)對(duì)各組兔行睪丸切除術(shù)，每次取3只睪丸。常規(guī)石蠟切片、HE染色，觀察睪丸內(nèi)生精上皮恢復(fù)情況;BrdU免疫組化觀察BM-M

13、SCs存活及遷移。最后，以RT-PCR半定量法測(cè)定各組睪丸組織p53、Dazl、Oct-4、c-kit的表達(dá)情況。
　　 結(jié)果:
　　 所有兔在實(shí)驗(yàn)階段均存活。移植順利，術(shù)后局部無感染發(fā)生。光鏡下組織形態(tài)學(xué)觀察:正常對(duì)照組兔睪丸生精小管內(nèi)充盈飽滿，各層細(xì)胞排列均勻，管腔內(nèi)有成熟精子。空白對(duì)照組睪丸生精小管內(nèi)各級(jí)生精細(xì)胞消失，管腔呈空腔化，仍可見正常支持細(xì)胞;陰性對(duì)照組在4-6w后，可見小部分生精小管內(nèi)可見生精上皮，細(xì)胞層

14、數(shù)較少。細(xì)胞移植組:在移植2-6w后，生精小管管腔內(nèi)細(xì)胞逐漸增多，細(xì)胞層數(shù)逐漸接近正常，未見精子。曲細(xì)精管中空率(RHST)比較:細(xì)胞移植組RHSTs在2、4、6w后依次降低，存在明顯差異(p＜0.05);細(xì)胞移植組在相同時(shí)間段與其他各組相比，細(xì)胞移植組均有明顯差異(p＜0.05)，除正常對(duì)照組外，細(xì)胞移植組比空白對(duì)照組及陰性對(duì)照組都低;6w后，細(xì)胞移植組RHST減低至近20％。移植2w后，MSCs均勻分布在睪丸生精小管腔靠中心部位，排

15、列略顯散亂;4、6W時(shí)可見MSCs遷移至生精小管基底部。RT-PCR提示自體MSCs移植睪丸6w后Dazl、Oct-4、c-kit表達(dá)增強(qiáng)。Dazl:正常對(duì)照組與單純照射組含量相似，陰性對(duì)照組與BM-MSCs移植組相似，都較前兩組升高，暗示可能視黃酸加強(qiáng)了Dazl的表達(dá);Oct-4:正常對(duì)照組與單純照射組相近;BM-MSCs移植組略有降低;陰性對(duì)照組較三者明顯減低，提示可能視黃酸降低了Oct-4的表達(dá);c-Kit:BM-MSCs移植組與

16、正常對(duì)照組相近，單純照射組與陰性對(duì)照組明顯降低，提示MSCs向生精細(xì)胞轉(zhuǎn)化，恢復(fù)了c-Kit的表達(dá);P53:BM-MSCs含量較低，其他3組含量相近，提示MSCs移植組凋亡受到抑制。
　　 結(jié)論:
　　 1、BM-MSCs經(jīng)睪丸網(wǎng)注射移植，方法簡單，效果確實(shí)。需要注意要有較高濃度的干細(xì)胞。
　　 2、經(jīng)睪丸網(wǎng)移植的BM-MSCs在生精小管內(nèi)存活，2周后已向基底膜遷移、增殖。形態(tài)學(xué)分析可見移植BM-MSCs后生精小