不同傳代自體骨髓間充質(zhì)干細胞移植治療股骨頭無菌性壞死的實驗研究.pdf

1、股骨頭缺血性壞死（avascular necrosis of femoral head, ANFH）是一種常見的骨壞死性疾病，與多種致病因素有關(guān)，可能存在多種發(fā)病機制。目前在ANFH的不同時期治療方法多種多樣，治療方法的選擇及其療效也還存在很大爭議。理想的治療應(yīng)在早期階段，目的主要是阻止骨質(zhì)繼續(xù)壞死，促進骨再生，改善股骨頭內(nèi)血液循環(huán)，恢復(fù)股骨頭的解剖和組織結(jié)構(gòu)，防止塌陷，改善臨床癥狀，恢復(fù)功能，延緩進行人工髖關(guān)節(jié)置換的時間。然而早期AN

2、FH治療方法雖多，但效果均不理想。近年來研究發(fā)現(xiàn)ANFH病人骨髓間充質(zhì)干細胞（bone marrow mesenchamal stem cells, BMSCs）數(shù)目下降，活力降低，認為ANFH可能是一種BMSCs減少性疾病，但目前尚缺乏利用培養(yǎng)的BMSCs移植治療ANFH的理論和實驗依據(jù)。BMSCs具有高度增殖和多向分化潛能，經(jīng)定向誘導(dǎo)可分化為骨、軟骨、神經(jīng)細胞等，目前已成為骨組織工程技術(shù)研究中最為重要的種子細胞。本實驗研究就BMSC

3、s的體外分離培養(yǎng)、擴增、誘導(dǎo)其向成骨方向分化及其移植對ANFH的治療作用進行觀察和分析，同時觀察比較不同傳代自體BMSCs移植治療ANFH的效果，旨在探討自體BMSCs移植對ANFH的治療作用、修復(fù)機理以及合理的治療方法，期望對進一步的臨床應(yīng)用有所指導(dǎo)和幫助。
　　 目的：1）對兔BMSCs進行體外分離培養(yǎng)、擴增和向成骨細胞誘導(dǎo)分化，觀察其生長規(guī)律、生物學(xué)特性和結(jié)構(gòu)特點并進行成骨細胞鑒定；2）采用液氮冷凍法建立兔ANFH疾病動物

4、模型，觀察股骨頭的壞死和自然修復(fù)過程，為后續(xù)的自體BMSCs移植治療ANFH的實驗研究建立疾病動物模型的基礎(chǔ)；3）體外培養(yǎng)、擴增并向成骨細胞誘導(dǎo)分化的不同傳代的自體BMSCs采用經(jīng)皮穿刺方法移植到經(jīng)液氮冷凍法建立的ANFH兔股骨頭中，對其治療作用進行觀察和分析比較，期望對進一步的臨床應(yīng)用有所指導(dǎo)和幫助。
　　 方法：第一部分實驗研究：抽取兔骨髓后通過全骨髓培養(yǎng)及貼壁篩選法對BMSCs進行體外分離培養(yǎng)、傳代、擴增和向成骨細胞方向誘

5、導(dǎo)分化，利用倒置相差顯微鏡、光學(xué)顯微鏡和電子顯微鏡觀察其生長規(guī)律、生物學(xué)特性和結(jié)構(gòu)特點，繪制原代及傳代BMSCs的生長曲線；BMSCs向成骨細胞誘導(dǎo)分化前后分別采用改良的Gonori鈣鈷法進行堿性磷酸酶組織化學(xué)染色觀察及采用Von Kossa染色檢測兔BMSCs的鈣化結(jié)節(jié)。第二部分實驗研究：10只成年新西蘭兔麻醉后通過手術(shù)切開顯露股骨頭負重區(qū)后采用液氮冷凍法制作ANFH疾病動物模型，術(shù)后觀察兔一般情況變化；分別于術(shù)后5天、2周、4周、8

6、周及12周以耳緣靜脈空氣栓塞法各處死2只兔后立即拍攝雙側(cè)髖關(guān)節(jié)正位X線片后，獲取兔股骨頭做大體解剖、形態(tài)學(xué)觀察，再制作H.E染色病理切片對股骨頭的壞死及修復(fù)情況進行組織病理學(xué)觀察并對空骨陷窩率進行測定。第三部分實驗研究：40只成年新西蘭兔隨機分成A，B，C，D，E五個組，每組8只兔。A組為單純造模對照組，B組為造模后原代自體BMSCs移植治療組，C組為造模后一代自體BMSCs移植治療組，D組為造模后二代自體BMSCs移植治療組，E組為造

7、模后三代自體BMSCs移植治療組。所有各組全部采用液氮冷凍股骨頭負重區(qū)的方法制作ANFH疾病動物模型。各治療組實驗動物于造模后5天分別將不同傳代和成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)后的自體BMSCs在X光機透視監(jiān)視下采用經(jīng)皮穿刺法移植到兔的壞死股骨頭中。對照組及各實驗組分別于造模及自體BMSCs移植術(shù)后2周、4周、8周及12周采用空氣栓塞法各處死2只動物，進行股骨頭標本的大體解剖形態(tài)學(xué)觀察、X線攝片檢查、光鏡病理組織學(xué)觀察分析以及電鏡組織學(xué)觀察分析。各組療效

8、評價還進一步采用病理圖像分析軟件對股骨頭冠狀截面骨小梁體積百分比、股骨頭冠狀截面血管密度和空骨陷窩陽性數(shù)等定量指標進行計算、統(tǒng)計學(xué)分析和評價。各組之間比較的統(tǒng)計分析方法采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件包做兩因素連續(xù)測量資料的方差分析，統(tǒng)計檢驗的顯著性水平α值取0.05。
　　 結(jié)果：第一部分實驗研究：經(jīng)全骨髓貼壁篩選法培養(yǎng)后，兔原代BMSCs生長相對較緩慢，呈放射狀克隆集落貼壁生長。消化傳代培養(yǎng)后生長速度加快，細胞呈長梭形分散排列

9、，生長較均勻一致，無原代細胞生長的集落形成。多次傳代培養(yǎng)后細胞呈更均勻有序的分布，仍增殖旺盛。堿性磷酸酶組織化學(xué)染色呈強陽性反應(yīng)，鈣化結(jié)節(jié)呈陰性反應(yīng)。經(jīng)向成骨細胞誘導(dǎo)培養(yǎng)的BMSCs生長旺盛，形體飽滿，體積逐漸增大，呈魚群樣排列。堿性磷酸酶組織化學(xué)染色和鈣化結(jié)節(jié)檢測均呈陽性反應(yīng)。掃描電鏡觀察顯示，BMSCs呈長梭形，大部分細胞為單核。經(jīng)過向成骨細胞分化誘導(dǎo)后，細胞體積增大，胞漿更為豐富，細胞呈現(xiàn)雙核增多現(xiàn)象。透射電鏡觀察顯示，未經(jīng)成骨誘

10、導(dǎo)的BMSCs以低電子密度為主，細胞核不規(guī)則，細胞間無明顯連接結(jié)構(gòu)。經(jīng)過誘導(dǎo)后的BMSCs以高電子密度為主，細胞間出現(xiàn)縫隙連接，細胞器更為豐富，分泌小泡及髓樣結(jié)構(gòu)大量增加，細胞核常呈圓形或橢圓形。第二部分實驗研究：采用液氮冷凍股骨頭負重區(qū)的方法，成功制作出了ANFH的動物模型，所有標本在影像學(xué)與組織學(xué)上均表現(xiàn)出骨壞死與修復(fù)過程。影像學(xué)上，造模后5天股骨頭密度及骨小梁結(jié)果仍基本正常，術(shù)后2周時骨密度減低，4周后骨密度逐漸開始增加，并出現(xiàn)骨

11、小梁結(jié)構(gòu)紊亂和囊性變，這些現(xiàn)象在造模后4周時最顯著；術(shù)后12周時骨小梁結(jié)構(gòu)紊亂和囊性變程度減輕。在組織學(xué)上，造模術(shù)后5天，液氮冷凍區(qū)及其周圍的軟骨細胞、骨細胞和骨髓組織呈現(xiàn)壞死，表現(xiàn)為骨陷窩內(nèi)骨細胞輪廓消失，細胞核固縮，骨陷窩空虛，空骨陷窩率最低70%，最高92%，髓腔充滿壞死的組織碎片，骨小梁結(jié)構(gòu)正常。術(shù)后4周時修復(fù)過程開始，8周時新生骨開始形成，12周時新生骨形成增多，修復(fù)已經(jīng)達到軟骨下骨板。第三部分實驗研究：經(jīng)皮穿刺不同傳代并成骨

12、誘導(dǎo)的自體BMSCs移植治療后不同時間點觀察發(fā)現(xiàn)B、C、D、E組大多數(shù)動物活動度增加及行走姿勢好轉(zhuǎn)時間均較A組縮短。X線片檢查發(fā)現(xiàn)B、C、D、E組股骨頭壞死的修復(fù)作用均較對照組強，修復(fù)時間縮短。對股骨頭標本的大體解剖、形態(tài)學(xué)觀察亦有著相同的發(fā)現(xiàn)。各組的光鏡組織病理學(xué)變化及電鏡超微結(jié)構(gòu)觀察都有壞死和修復(fù)現(xiàn)象，但B、C、D、E組較A組修復(fù)的時間更快，修復(fù)程度更好。利用均值對各實驗組及各觀察時間點的股骨頭冠狀截面骨小梁體積百分比、血管密度及空

13、骨陷窩計數(shù)分別進行兩因素連續(xù)測量資料的總體方差分析，結(jié)果均有顯著的統(tǒng)計學(xué)差異，并且在各實驗因素和觀察時間點之間沒有交互作用。對照組及各實驗組股骨頭冠狀截面骨小梁體積百分比之間進行兩兩比較，只有對照組和二代自體BMSCs移植組之間具有顯著的統(tǒng)計學(xué)差異（P=0.043），雖然第三代自體BMSCs移植組和對照組之間差異沒有達到統(tǒng)計學(xué)顯著性（0.087），但第二代和第三代自體BMSCs移植組之間沒有統(tǒng)計學(xué)差異（P=1.00）。從平均數(shù)看，第三代

14、自體BMSCs移植治療組的骨小梁生長情況僅次于第二代BMSCs移植組。骨小梁體積百分比變化曲線圖顯示，對照組的骨小梁體積百分比一直處于低水平，恢復(fù)較慢；而第二代自體BMSCs移植組的骨小梁體積百分比較高，且在第四周之后恢復(fù)較快，生長良好。
　　 結(jié)論：第一部分實驗研究：全骨髓培養(yǎng)和貼壁篩選法操作簡單、成本低廉、對細胞損傷小，可以作為獲得和擴增BMSCs的可靠方法。BMSCs在體外可以通過定向誘導(dǎo)促使其向成骨細胞分化，表達堿性磷酸

15、酶和鈣化結(jié)節(jié)。確定BMSCs可靠的方法是檢測其成骨誘導(dǎo)分化后產(chǎn)生的礦化或鈣化結(jié)節(jié)，主要通過Von Kossa染色識別。BMSCs在體外經(jīng)過向成骨細胞誘導(dǎo)后細胞器更為豐富，細胞間縫隙連接及大量的基質(zhì)小泡、髓樣結(jié)構(gòu)的出現(xiàn)可能是BMSCs向成骨細胞誘導(dǎo)分化后的超微結(jié)構(gòu)特征。第二部分實驗研究：液氮冷凍法能夠成功復(fù)制兔ANFH疾病動物模型，其病理變化過程可以反映出人類ANFH的演變過程，是一個壞死程度和壞死時間可以控制的標準化的動物模型。本疾病動

16、物模型制作簡便易行，造模成功率高，成模周期短，動物死亡率低，可重復(fù)性強，ANFH后有自我修復(fù)反應(yīng)，可以作為股骨頭壞死治療研究的良好的疾病動物模型。第三部分實驗研究：經(jīng)皮穿刺將預(yù)先分離培養(yǎng)并向成骨細胞誘導(dǎo)分化的不同傳代的自體BMSCs注入實驗動物股骨頭壞死區(qū)，既降低了骨內(nèi)壓，又解決了BMSCs數(shù)量少、活性低的問題，從細胞水平上為骨的生長修復(fù)創(chuàng)造了條件。從治療后各項指標觀察，總體上均顯示不同傳代的自體BMSCs移植對早期ANFH有較為確切的

17、治療作用。該方法操作簡便、創(chuàng)傷小，無排斥反應(yīng)，為早期ANFH的治療提供新的治療思路，有很大的臨床應(yīng)用潛力。進一步用空骨陷窩計數(shù)、冠狀截面血管密度以及骨小梁體積百分比等定量指標進行綜合分析，顯示二代自體BMSCs移植治療ANFH效果最好，其次為第三代自體BMSCs。在采用自體BMSCs移植修復(fù)ANFH時，應(yīng)盡可能提高BMSCs移植的的數(shù)量，這可以通過BMSCs多次傳代培養(yǎng)擴增實現(xiàn)，從而可提高其治療ANFH的效果。第二代和第三代自體BMSC