Ad-HGF轉染間充質干細胞治療股骨頭缺血壞死的實驗研究及影像學觀察.pdf

1、研究目的
　　 1.利用腺病毒表達載體將肝細胞生長因子轉染兔骨髓間充質干細胞,用流式細胞術檢測基因轉染效率,原位雜交及免疫組化檢測轉染后外源基因HGF的表達。
　　 2.建立激素性早期兔股骨頭缺血壞死模型,用CT灌注成像及MRI動態(tài)增強進行影像學觀察,探討ANFH影像學灌注異常與股骨頭血流動力學改變及病理改變的關系。
　　 3.經皮股骨頭穿刺,向兔缺血壞死股骨頭內移植轉染HGF基因的BMSCs,行CTP、DCE-

2、MRI及病理檢查,探討Ad-HGF轉染BMSCs對改善股骨頭血供、促進壞死修復、骨質重建的作用,以及影像學對基因治療ANFH的監(jiān)測作用。
　　 材料與方法：
　　 1Ad-HGF轉染骨髓間充質干細胞的制備及體外實驗1.1腺病毒載體Ad-HGF、Ad-GFP的構建攜帶HGF基因和報告基因-綠色熒光蛋白(greenfluorescenceprotein,GFP)的重組腺病毒(adenovirus)載體Ad-HGF、Ad-GF

3、P,均委托本元正陽基因技術有限公司構建。
　　 1.2兔BMSCs的分離培養(yǎng)抽取4周齡純新西蘭大白兔骨髓15ml,離心去除表面上清及脂肪細胞,加10％胎牛血清DMEM培養(yǎng)液置于培養(yǎng)箱中接種培養(yǎng),更換培養(yǎng)液時棄掉懸浮細胞,待貼壁細胞長至接近融合時(2周),胰酶消化,傳代培養(yǎng)至第二代細胞時備用。
　　 1.3Ad-GFP轉染BMSCs轉染效率及表達持續(xù)時間的檢測
　　 1.4原位雜交及免疫組化檢測HGF在BMSCs中

4、的表達以MOI=300的Ad-HGF轉染BMSCs,胰酶消化并收集細胞；將轉染后的BMSCs滴加于硅化玻片上,制備細胞爬片,進行原位雜交及免疫組化檢測。
　　 2兔股骨頭缺血壞死模型的建立及影像學觀察
　　 3Ad-HGF轉染BMSCs治療兔股骨頭缺血壞死的初步研究及影像學觀察
　　 4墨汁灌注及病理動物麻醉,手術暴露并穿刺腹主動脈,生理鹽水加壓灌洗,將墨水與右旋糖酐以7:3的比例混合,注入血管約100ml,至雙

5、下肢皮膚、甲床變?yōu)楹谏?。取材、固定、脫鈣、切片,立體顯微鏡觀察股骨頭血管分布。
　　 實驗兔處死后,剖取雙側股骨頭連同干骺端,固定、脫鈣,石蠟包埋,切片,HE染色,光鏡觀察骨小梁、造血組織的變化。
　　 5統(tǒng)計學分析
　　 采用SPSS13.0軟件包進行統(tǒng)計學分析。
　　 所有數(shù)據(jù)均以(均值±標準差)表示,體外實驗中表達GFP的陽性細胞率、正常與模型組間CTP各灌注參數(shù)及DCE-MRI最大強化率及最大強化

6、斜率的比較,采用完全隨機設計資料的方差分析方法(one-wayANOVA),P<0.05,被認為有顯著性差異。
　　 基因治療組、單純穿刺組及自然修復組之間以及不同治療時間CTP灌注參數(shù)及DCE-MRI峰值強化率及強化斜率的比較,采用完全隨機設計資料重復測量數(shù)據(jù)的方差分析方法(repeatedmeasures),P<0.05,被認為有顯著性差異。
　　 結果
　　 1.Ad-HGF轉染骨髓間充質干細胞的制備及體外

7、實驗1.1Ad-GFP轉染BMSCs轉染效率及表達持續(xù)時間的檢測Ad-GFP以不同的MOI轉染兔BMSCs48h后,表達GFP的陽性細胞率有顯著性差異(P<0.05),隨著MOI的增加,表達GFP的陽性細胞率逐漸增加,但當MOI大于200以上,表達GFP的陽性細胞率無顯著性差異(P>0.05)；MOI=300時表達GFP的陽性細胞率達98％以上,因此選擇MOI=300轉染BMSCs。
　　 Ad-GFP以MOI=300轉染兔BM

8、SCs后不同時間,表達GFP的陽性細胞率有顯著性差異(P<0.05)。轉染后24h即可見GFP表達,2至7天時表達最高,7天后顯著下降,28天時仍可檢測到GFP的表達。
　　 1.2原位雜交及免疫組化檢測HGF在兔BMSCs中的表達將Ad-HGF以MOI=300轉染兔BMSCs后,原位雜交及免疫組化檢測結果顯示:細胞的胞核和胞漿中有棕黃色顆粒性陽性雜交信號,胞漿內有豐富的HGF蛋白表達,表明Ad-HGF可高效轉染BMSCs,并B

9、MSCs有HGFmRNA及蛋白的高表達。
　　 2兔股骨頭缺血壞死模型的建立及影像學觀察2.1CT2.1.1常規(guī)CT模型組兔股骨頭表現(xiàn)較輕,僅可見股骨頭皮質模糊,皮質下松質骨內小點狀低密度影,骺線模糊不清,干骺端密度增高。
　　 2.1.2CTPTDC曲線模型3周組兔股骨頭TDC形態(tài)與正常對照組相似；模型4周組TDC上升段緩慢并幅度減小,波峰更平滑持續(xù)時間更長；模型5周組TDC呈低平型。
　　 2.1.3CTP灌

10、注參數(shù)比較正常組及模型各組股骨頭BF、BV、PS值均有顯著性差異(P<0.05)。
　　 2.2MRI
　　 2.2.1常規(guī)MRI模型兔股骨頭表現(xiàn)為關節(jié)積液增多；皮質下骨髓中可見小點狀或條狀T2WI高信號影,以FS-T2WI顯示最清楚；干骺端T2WI高信號；股骨干骨髓水腫,T2WI及FS-T2WI高信號。
　　 2.2.2DCE-MRISI-T曲線模型3周組股骨頭SI-T曲線形狀及上升幅度均與正常組接近(約200

11、左右);模型4周組股骨頭SI-T曲線形狀同前,但上升幅度開始降低(約100左右)；模型5周組股骨頭SI-T曲線上升幅度明顯降低,僅上升約50左右。
　　 2.2.3時間En％曲線及峰值強化情況正常組與模型3周組股骨頭時間-En％曲線接近,模型4周組曲線下降,模型5周組曲線下降更明顯,曲線最低。
　　 2.3墨汁灌注及病理正常股骨頭HE染色:骨膜光滑,軟骨細胞排列整齊；骨小梁完整規(guī)則,空骨陷窩少見；骨髓造血細胞豐富,脂肪細

12、胞相對較少。墨汁灌注骨髓腔內毛細血管豐富,形成血管網(wǎng),血管結構清晰。
　　 模型組股骨頭HE染色:軟骨部分脫落,骨小梁稀疏變細,空骨陷窩增多；骨髓腔內造血組織明顯減少,細胞數(shù)目及網(wǎng)狀結構較正常稀疏,脂肪細胞體積增大,部分融合成泡狀。墨汁灌注顯示股骨頭血管顯著減少,骨髓腔內毛細血管稀疏,灌注不全面。
　　 3Ad-HGF轉染BMSCs治療兔股骨頭缺血壞死的初步研究及影像學觀察3.1CT基因治療組2周時CTPTDC形態(tài)有不同

13、程度的上升,表現(xiàn)為類似正常股骨頭TDC形態(tài),但上升的幅度較正常略低,約25-30Hu左右；4周時股骨頭TDC形態(tài)基本與2周時相似,但上升幅度下降,約20Hu左右。單純穿刺組2周時股骨頭CTPTDC形態(tài)亦表現(xiàn)類似基因治療組,但上升幅度較低,4周時曲線上升幅度下降,呈現(xiàn)低平型。自然修復組CTPTDC曲線形態(tài)呈低平型。
　　 3.2MRI治療2周時,基因治療組與單純穿刺組股骨頭SI-T曲線均有不同程度的上升,但基因治療組較單純穿刺組上

14、升幅度明顯；4周時,基因治療組股骨頭SI-T曲線仍有上升,單純穿刺組股骨頭SI-T曲線上升不明顯。
　　 3.3墨汁灌注及病理基因治療組HE染色見小血管數(shù)目增多,造血細胞增多,骨小梁成骨活躍,新骨形成,并可見組織的重建和修復現(xiàn)象；墨汁灌注顯示軟骨下骨小梁內的骨髓中血管網(wǎng)增多,小血管較豐富。
　　 結論
　　 1.Ad-GFP可成功轉染骨髓間充質干細胞,Ad-GFP以MOI=300轉染BMSCs,轉染率可達98％以

15、上,24h即可見綠色熒光,2-7天轉染率最高,28天仍可見轉染。表明重組腺病毒作為載體轉染骨髓間充質干細胞具有高轉染率與穩(wěn)定表達。
　　 2.骨髓間充質干細胞作為靶細胞,來源充足、取材較容易、體外分離培養(yǎng)純化可大量擴增,操作性強。
　　 3.原位雜交及免疫組化檢測結果表明,Ad-HGF可高效轉染BMSCs,并有HGFmRNA及蛋白的高表達。
　　 4.馬血清加激素誘導早期兔股骨頭缺血壞死的成模率及動物存活率較高,

16、病理改變主要為空骨陷窩增多,骨髓內造血細胞減少,脂肪細胞大量聚集,體積增大,壓迫髓內血管床造成股骨頭缺血,與ANFH的影像學表現(xiàn)密切相關。
　　 5.CT灌注成像及MRI動態(tài)增強掃描均能較好反映股骨頭血流動力學改變,可定量觀察ANFH股骨頭微循環(huán)的改變。缺血的股骨頭血流灌注降低,表現(xiàn)為CTP灌注參數(shù)BF、BV及PS降低,TDC峰值強化下降；DCE-MRI間間-強化率曲線下降,En％max及EnR降低,并隨著時間的延長呈逐漸下降趨

17、勢。
　　 6.CT灌注成像及MRI動態(tài)增強掃描均能較好反映ANFH股骨頭血流動力學改變,可定量監(jiān)測ANFH基因治療后股骨頭微循環(huán)的改變。Ad-HGF轉染BMSCs可增加股骨頭血流灌注,表現(xiàn)為股骨頭CTP灌注參數(shù)BF、BV及PS值升高、TDC峰值強化增加；DCE-MRI時間-強化率曲線上升,En％max及EnR增加。
　　 7.Ad-HGF轉染的BMSCs植入ANFH股骨頭后,病理證實股骨頭血管數(shù)目增多,骨小梁成骨活躍,