關節(jié)鏡監(jiān)視下hBMP-2基因轉染骨髓間充質干細胞植入治療股骨頭缺血性壞死的實驗研究.pdf

1、關節(jié)鏡監(jiān)視下hBMP-2基因轉染骨髓間充質干細胞治療股骨頭缺血性壞死骨髓基質系統中含有非造血組織的干細胞，因其能分化為骨、軟骨、脂肪、肌肉、肌腱、骨髓基質等多種間充質組織的細胞而統稱為間充質干細胞(Mesenchymal stem cells，MSCs)或骨髓基質干細胞(Bone marrow stromal stem cells，BMSCs)。對股骨頭缺血性壞死、骨組織工程學的研究表明，骨髓間充質干細胞不僅充當骨生成細胞的來源，而且可

2、作為基因治療技術適宜的細胞載體。 股骨頭缺血性壞死的修復與重建是骨科常見的難題，臨床亟需能夠有效促進股骨頭修復的新方法。對骨發(fā)生和修復的研究證實，成骨細胞的形成與成骨能力的增強是骨形成的關鍵環(huán)節(jié)，BMP-2(Bone Morphogenetic Protein-2)是其中關鍵的骨形成因子，不僅可以促進成骨細胞的再生、遷移、聚集，并且介導成骨細胞、軟骨細胞、破骨細胞、破軟骨細胞的分化及功能。因此，BMP一2促進成骨能力可望成為骨科

3、疾病臨床治療的新途徑。然而，直接將BMP-2應用于股骨頭壞死處易被周圍組織中的酶類所降解，作用時間短?；蛑委熌芸朔鲜鋈秉c，近年來應用BMP-2基因治療骨缺損等各種骨科疾病成為國內外研究的熱點，并已開始進行臨床試驗。本研究擬以兔MSCs為細胞模型，闡明體內外培養(yǎng)兔MSCs的生長特性及其成骨潛能，構建rAAV-2-hBMP-2轉染的兔MSCs復合物，探討其在修復兔股骨頭缺血性壞死中的作用，為股骨頭缺血性壞死的組織工程治療提供實驗基礎。

4、 目的：探討hBMP-2轉染的骨髓間充質干細胞的生物學特性，及其在體外培養(yǎng)中的成骨能力。研究髓芯減壓關節(jié)鏡監(jiān)視下hBMP-2基因轉染骨髓間充質干細胞在治療股骨頭缺血性壞死中的作用及價值。 方法：在無菌條件、戊巴比妥鈉麻醉(30mg/Kg)下，雙側股骨外側髁和脛骨近端穿刺獲取成年新西蘭白兔(6月齡，體重2.5-3.0Kg)骨髓，采用密度梯度離心方法分離兔骨髓間充質干細胞并大量擴增，加入10 ml的1640(含10％的胎牛血清

5、)進行培養(yǎng)。倒置顯微鏡下觀察細胞形態(tài)和生長情況，鈣結節(jié)染色、堿性磷酸酶染色檢測骨髓間充質干細胞的成骨能力。研究兔骨髓間充質干細胞的成骨潛能。制備rAAV-2-hBMP-2，以腺相關病毒介導hBMP-2轉染兔骨髓間充質干細胞，在細胞90％匯合后行病毒轉染過夜，感染被率(MOI)為100，每瓶約加1∶2稀釋的病毒液約4ml，換液后繼續(xù)培養(yǎng)。收獲轉染后24h至6d的轉染上清，應用Westernblot檢測轉染MSCs中辛外源hBMP-2基因的

6、轉錄與表達。36只新西蘭白兔建立液氮即刻冷凍股骨頭缺血性壞死模型，根據不同移植物隨機分為3組，每組12只，A組為空白骨壞死對照組，B組為髓芯減壓并MSCs組，C組髓芯減壓并hBMP-2轉染MSCs組。關節(jié)鏡監(jiān)視并對壞死骨清除后植入骨髓間充質干細胞，術后4周和8周對股骨頭行組織學檢查。 結果：原代培養(yǎng)中，第4天首次換液，成纖維細胞樣細胞貼壁于培養(yǎng)瓶底，并有少數克隆形成，即來源于成纖維細胞克隆形成單位(Colony-forming

7、unit-fibroblasts,CFLJ-Fs)。第7-10天期間，克隆逐漸增多、增大，形成直徑5mm-8mm的較大克隆和(5mm的小克隆。隨著培養(yǎng)時間的延長鈣結節(jié)逐漸增多，細胞間出現致密圓形不透光團塊，經von Kossa染色呈現片狀的棕染，著色區(qū)域范圍廣、面積大；大部分堿性磷酸酶染色的骨髓間充質干細胞呈陽性反應。hBMP-2基因轉染的兔骨髓間充質干細胞可有效表達hBMP-2，其分泌于培養(yǎng)上清中的蛋白產物有促進兔成骨細胞增值及增加成

8、骨細胞活性的作用。組織形態(tài)學檢測發(fā)現植入后4周c組有明顯成骨，8周時壞死區(qū)被完全修復：B組只有較少新骨形成，8周時壞死區(qū)仍多為纖維組織。C組新骨體積明顯大于B組。造模后8周A組股骨頭塌陷：植入后8周B組股骨頭存在囊狀密度減低區(qū)：C組股骨頭形態(tài)規(guī)則，無塌陷。 結論：體外培養(yǎng)的兔骨髓間充質干細胞是具有成克隆性、自我更新能力的成纖維樣細胞；hBMP-2基因轉染的兔骨髓間充質干細胞可有效表達具有生物活性的hBMP-2蛋白，對以hBMP-