骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞和傘狀支撐骨移植術(shù)治療股骨頭壞死的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：
　　 股骨頭壞死(Osteonecrosis of the Femoral Head，ONFH)是由于多種病因破壞股骨頭血供使骨的活性成分(包括骨細(xì)胞、骨髓造血細(xì)胞和脂肪細(xì)胞)死亡的一種病理過程。該病發(fā)病率高，若未經(jīng)有效治療，約80％的患者將在1～4年內(nèi)發(fā)生股骨頭塌陷，關(guān)節(jié)功能毀壞，最終不得不接受人工全髖關(guān)節(jié)置換。但由于該病多發(fā)于中青年，且多為雙側(cè)關(guān)節(jié)同時(shí)受累，中青年實(shí)行人工關(guān)節(jié)置換術(shù)后遠(yuǎn)期療效尚不理想。所以股骨頭壞死的

2、治療目標(biāo)除了改善臨床癥狀外，更重要的是防止股骨頭塌陷，延緩病變發(fā)展，盡量保留患者自身的股骨頭，推遲甚至避免人工關(guān)節(jié)置換術(shù)。保留股骨頭的理想治療方法是既能有效改善股骨頭的血液供應(yīng)，加強(qiáng)壞死骨的修復(fù)，又能恢復(fù)股骨頭的生物力學(xué)性能，防止塌陷。目前臨床上尚無達(dá)到上述要求的理想方法。本研究將骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞和傘狀支撐骨植入山羊股骨頭壞死模型，通過影像學(xué)、組織學(xué)和生物力學(xué)檢查觀察其修復(fù)過程，探索一種新的治療股骨頭壞死的方法。
　　 本研究分

3、為三個(gè)部分。
　　 方法：
　　 第一部分：改良的液氮冷凍法建立山羊股骨頭壞死模型。12只健康1周歲中國(guó)青山羊均采用改良的液氮冷凍法隨機(jī)側(cè)別建立單側(cè)股骨頭壞死模型，采取髖關(guān)節(jié)后側(cè)入路，不脫位髖關(guān)節(jié)，不切開關(guān)節(jié)囊，自關(guān)節(jié)囊邊緣向股骨頭負(fù)重區(qū)方向鉆孔，用棉簽蘸取液氮涂抹于孔內(nèi)冷凍。分別于造模術(shù)后2天、2周、4周、8周分批處死(每批3只)行放射學(xué)、組織學(xué)觀察。
　　 第二部分：山羊骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞體外分離、培養(yǎng)及鑒定。

4、取健康1周歲中國(guó)青山羊，髂骨穿刺抽取髂骨骨髓，采用密度梯度離心法分離骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，結(jié)合貼壁篩選法進(jìn)行培養(yǎng)。觀察細(xì)胞形態(tài)及生長(zhǎng)情況，測(cè)定細(xì)胞成活率及傳代細(xì)胞貼壁率，對(duì)第2，4，6代細(xì)胞采用連續(xù)計(jì)數(shù)法繪制出生長(zhǎng)曲線，計(jì)算細(xì)胞倍增時(shí)間，免疫細(xì)胞化學(xué)染色法鑒定細(xì)胞表面抗原標(biāo)志。
　　 第三部分：骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞和傘狀支撐骨移植術(shù)治療股骨頭壞死的實(shí)驗(yàn)研究。44只健康1周歲中國(guó)青山羊全部用改良的液氮冷凍法隨機(jī)側(cè)別制作單側(cè)股骨頭壞死模型。

5、造模8周后，隨機(jī)挑選2只處死，行放射學(xué)、組織學(xué)檢查檢測(cè)造模情況。余42只隨機(jī)分為A、B、C三組(每組14只)，于模型側(cè)分組施術(shù)。A組為骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞和傘狀支撐骨移植術(shù)組。采取髖關(guān)節(jié)后側(cè)入路進(jìn)入，鑿取帶股方肌蒂骨柱，同時(shí)在取骨柱處鑿取4～6根帶皮質(zhì)骨的小骨柱，清除股骨頭內(nèi)死骨后取已制備好的山羊自身的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞懸液混合于小部分松質(zhì)骨植于股骨頭軟骨下，并于股骨頭內(nèi)的前、后、內(nèi)、外多方向植入4～6根小骨柱，中間植入帶股方肌蒂骨柱(大骨柱

6、)，周圍空腔用松質(zhì)骨填充壓實(shí)，使這些骨柱支撐類似撐開的傘狀；B組為單純股方肌骨柱移植術(shù)組；C組為骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞和松質(zhì)骨移植術(shù)組。徹底清除壞死骨，在壞死側(cè)股骨頭內(nèi)先植入其自身的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，但是不植骨柱，僅為打壓植入松質(zhì)骨。三組的健側(cè)均作為自身正常對(duì)照。分別于術(shù)后3、6個(gè)月行放射學(xué)、組織學(xué)檢查及生物力學(xué)測(cè)定。
　　 結(jié)果：
　　 第一部分術(shù)后2天，股骨頭出現(xiàn)骨細(xì)胞壞死，X線檢查模型側(cè)可見低密度針道影；術(shù)后2周可見骨髓

7、纖維化，骨小梁周圍骨髓基質(zhì)細(xì)胞增多，X線顯示針道影模糊，模型側(cè)股骨頭無明顯骨壞死改變；4周時(shí)可見修復(fù)反應(yīng)出現(xiàn)，X線顯示股骨頭負(fù)重區(qū)出現(xiàn)囊性變，周圍骨質(zhì)硬化；8周時(shí)模型側(cè)股骨頭骨小梁變細(xì)、稀疏、斷裂、排列紊亂，骨細(xì)胞變性死亡，可見大量空骨陷窩，軟骨表面毛糙，部分脫落，軟骨下骨壞死區(qū)可見增生結(jié)締組織，X線顯示模型側(cè)股骨頭骨密度不均，負(fù)重區(qū)軟骨面輕度塌陷。各組正常側(cè)股骨頭均無異常變化。
　　 第二部分骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞原代細(xì)胞呈“滿天星

8、”樣分布，圓形，大小均勻，周圍有少量血細(xì)胞。培養(yǎng)24h后部分細(xì)胞貼壁，呈橢圓形。48 h后更多細(xì)胞貼壁，呈梭形、多角形。4～6d后形成細(xì)胞集落，隨培養(yǎng)進(jìn)行細(xì)胞集落逐漸增多，12～14d長(zhǎng)滿瓶底80％，即可行細(xì)胞傳代。傳代后4h細(xì)胞貼壁，1—6代細(xì)胞12h貼壁率大于90％，24h貼壁率可達(dá)100％。6～8d長(zhǎng)滿瓶底，細(xì)胞融合率可達(dá)100％，1—6代細(xì)胞成活率均大于95％。傳代細(xì)胞呈均一長(zhǎng)梭形，細(xì)胞膜及細(xì)胞核清晰，細(xì)胞密度較高時(shí)呈放射狀、漩

9、渦狀排列。第2代骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞免疫組化染色，細(xì)胞表面抗原CD29，CD44呈陽(yáng)性表達(dá)(胞漿呈黃褐色染色)，CD34，CD45呈陰性表達(dá)。生長(zhǎng)曲線呈S型，1～2d為潛伏期；2～3d后進(jìn)入對(duì)數(shù)增長(zhǎng)期；6～7d后進(jìn)入平臺(tái)期。第2，4，6代細(xì)胞倍增時(shí)間分別為25．61h，27．89h，28．66h，平均倍增時(shí)間為(27．38±2．03)h。
　　 第三部分治療術(shù)后3個(gè)月：(1)X線檢查：A組、B組手術(shù)側(cè)股骨頭外形恢復(fù)，囊性低密度區(qū)消失

10、，原塌陷已修復(fù)，股骨頭無再塌陷。A組植骨愈合良好，骨柱影己模糊；B組植骨愈合欠佳，骨柱影仍較清晰；C組手術(shù)側(cè)骨修復(fù)效果明顯較A組、B組差，股骨頭輪廓不規(guī)則，扁平塌陷，密度不均。(2)組織學(xué)觀察：A組骨小梁成熟，排列規(guī)則；B組骨小梁幼稚，排列不規(guī)則；C組骨小梁變細(xì)、稀疏、斷裂。①3組手術(shù)側(cè)和正常側(cè)股骨頭骨小梁面積分?jǐn)?shù)百分比分別為：(40．18±2．71和41．90±2．52)、(36．21±2．46和41．56±2．35)、(31．42±

11、2．74和41．90±2．48)％。A組骨小梁面積分?jǐn)?shù)百分比高于B組、C組(P<0．05)，與正常側(cè)比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p>0．05)。②3組手術(shù)側(cè)和正常側(cè)空骨陷窩計(jì)數(shù)百分比分別為：(12．01±1．53和11．53±1．32)、(18．35±1．51和11．68±1．21)、(22．23±1．12和11．47±1．26)％。A組空骨陷窩計(jì)數(shù)百分比低于B組、C組(P<0．05)，與正常側(cè)比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p>0．05)。(3)生物

12、力學(xué)檢測(cè)：3組手術(shù)側(cè)和正常側(cè)股骨頭軟骨下骨最大壓縮強(qiáng)度和平均彈性模量分別為：(77．43±2．65和120．60±4．18)、(64．43±1．55和84．85±2．31)、(42．10±1．25和54．72±2．09)MPa，(82．61±2．02和127．37±4．74)、(83．09±1．23和126．36±1．39)、(83．91±1．32和126．85±2．88)MPa。3組手術(shù)側(cè)和正常側(cè)股骨頭松質(zhì)骨的最大壓縮強(qiáng)度和平均彈性模

13、量分別為：(46．63±1．32和81．74±3．96)、(39．48±0．75和63．78±1．27)、(30．83±0．73和45．90±2．34)MPa，(48．75±0．72和87．77±2．01)、(48．65±0．83和86．42±1．39)、(48．78±0．72和87．34±1．61)MPa。A組手術(shù)側(cè)股骨頭軟骨下骨、松質(zhì)骨的最大壓縮強(qiáng)度和平均彈性模量高于B組、C組(p<0．05)，與正常側(cè)比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p>0．

14、05)。治療術(shù)后6個(gè)月：X線檢查A組、B組手術(shù)側(cè)股骨頭已為正常股骨頭X線表現(xiàn)，而C組手術(shù)側(cè)股骨頭已完全塌陷。組織學(xué)檢查A組、B組手術(shù)側(cè)股骨頭空骨陷窩計(jì)數(shù)百分比、骨小梁面積分?jǐn)?shù)百分比與正常側(cè)比較差異已無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0．05)，且A、B組差異亦無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0．05)。生物力學(xué)測(cè)試顯示A組、B組手術(shù)側(cè)股骨頭軟骨下骨、松質(zhì)骨的最大壓縮強(qiáng)度和平均彈性模量與正常側(cè)比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p>0．05)，且A、B組差異亦無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p>0．

15、05)
　　 結(jié)論：
　　 第一部分采用改良的液氮冷凍法可以制作出股骨頭壞死伴關(guān)節(jié)面輕度塌陷的動(dòng)物模型。該造模方法動(dòng)物死亡率低，壞死成功率高，操作簡(jiǎn)單，創(chuàng)傷較小，可重復(fù)性大，不破壞關(guān)節(jié)面及髖關(guān)節(jié)的穩(wěn)定性，適合模擬臨床上開窗減壓植骨治療股骨頭壞死的實(shí)驗(yàn)研究。
　　 第二部分應(yīng)用密度梯度離心法結(jié)合貼壁培養(yǎng)法獲得的山羊骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞純度較高，生長(zhǎng)狀態(tài)良好。通過免疫細(xì)胞化學(xué)染色法鑒定細(xì)胞表面抗原標(biāo)志，結(jié)合細(xì)胞生物學(xué)特性