重組合異種骨復(fù)合VEGF基因轉(zhuǎn)染骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)兔非創(chuàng)傷性股骨頭壞死修復(fù)的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：1.探討體外骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)的體外分離、培養(yǎng)和鑒定的方法。2.探討血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子(VEGF)基因轉(zhuǎn)染MSCs的表達(dá)。3.研究重組合異種骨(RBX)復(fù)合VEGF基因轉(zhuǎn)染的MSCs對(duì)非創(chuàng)傷性股骨頭壞死(nontraumatic osteonecrosis of femoral head.NONFH)修復(fù)的治療療效。 方法：1.MSCs取自4-6月齡2.5-3.5kg的青紫蘭兔，用貼壁培養(yǎng)篩選法結(jié)合密度梯度離心

2、法進(jìn)行分離培養(yǎng)后行細(xì)胞表型的鑒定。2.采用脂質(zhì)體Lipofcetin轉(zhuǎn)染法將hVEGF-165基因轉(zhuǎn)染進(jìn)入骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，通過(guò)RT-PCR、Western Blot和免疫組化S-P法檢測(cè)轉(zhuǎn)染細(xì)胞外源性hVEGFl65基因瞬時(shí)表達(dá)與穩(wěn)定表達(dá)。3。用局部液氮冷凍法建立兔NONFH模型24只(共48髖)，隨機(jī)分為治療組和對(duì)照組，各24髖。治療組股骨頭壞死區(qū)植入復(fù)合VEGF基因轉(zhuǎn)染骨髓問(wèn)充質(zhì)干細(xì)胞的重組合異種骨，對(duì)照組僅植入重組合異種骨，行X

3、線大體標(biāo)本，組織病理檢查及股骨骨密度和礦物質(zhì)含量檢查，所得數(shù)據(jù)輸入SPSS1 3.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，比較兩組組間及組內(nèi)的差異是否具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 結(jié)果：1.本實(shí)驗(yàn)分離培養(yǎng)的MSCS形態(tài)學(xué)特征明顯，免疫細(xì)胞化學(xué)方法鑒定結(jié)果為CD44、CD90陽(yáng)性表達(dá)，CD34陰性表達(dá)。2.基因轉(zhuǎn)染后MSCs生長(zhǎng)增殖良好，基因轉(zhuǎn)染后72h和篩選培養(yǎng)4周后，RT-PCR、Western Blot和免疫組化都能檢測(cè)到VEGF基因的轉(zhuǎn)錄及表達(dá)，而空載體

4、轉(zhuǎn)染組未見(jiàn)其轉(zhuǎn)錄及表達(dá)。3.在X線上，兩組第2周，相差不大，壞死區(qū)密度均較低；第6周時(shí)治療組壞死區(qū)出現(xiàn)骨小梁結(jié)構(gòu)，新骨形成增加，骨密度較對(duì)照組高；第12周時(shí)治療組股骨頭形態(tài)規(guī)則，密度均勻，接近于正常兔股骨頭密度，對(duì)照組股骨頭壞死區(qū)有囊狀低密度區(qū)。骨密度和礦物質(zhì)含量測(cè)定上，2周時(shí)兩組比較無(wú)明顯差別，6周和12周時(shí)兩組差異有顯著差異性(p<0.01)。在組織學(xué)上，2周時(shí)所有兔股骨頭骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、骨髓細(xì)胞完全壞死，骨小梁完整；6周時(shí)治療組

5、骨細(xì)胞及微毛細(xì)血管明顯多于對(duì)照組；12周治療組新生骨組織修復(fù)達(dá)軟骨下，對(duì)照組植入骨塊仍有少量未吸收。 結(jié)論：1.采用梯度密度離心法分離結(jié)合貼壁篩選法可獲得較高純度和活性的MSCs，并能大量增殖；2.通過(guò)脂質(zhì)體介導(dǎo)能成功的將hVEGF165基因轉(zhuǎn)入MSCs，使其在mRNA和蛋白質(zhì)水平均有VEGF的穩(wěn)定表達(dá)。3.重組合異種骨復(fù)合VEGF基因轉(zhuǎn)染骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞不僅能促進(jìn)毛細(xì)血管的生成，而且有明顯的成骨誘導(dǎo)作用，能有效促進(jìn)非創(chuàng)傷性股骨