Shh基因轉(zhuǎn)染骨髓間充質(zhì)干細胞治療急性缺血性心臟病的實驗研究.pdf

1、急性心肌梗死是指心肌急性缺血、缺氧所引起的心肌壞死，是人類心衰和猝死的重要原因之一。隨著我國人民生活水平的提高，其在我國的發(fā)病率也不斷升高。在急性心肌梗死后，由于心肌細胞嚴重喪失，直接導(dǎo)致心臟舒縮功能下降、血流動力學(xué)改變、心室重構(gòu)及其他器官的繼發(fā)性病變。在急性心肌梗死后，梗死區(qū)內(nèi)部及周邊的心肌細胞及干細胞的修復(fù)作用有限，所以這種修復(fù)不足以中止或逆轉(zhuǎn)心?；颊卟∏榈陌l(fā)展[1]。目前在終末期心衰的治療上，心臟移植在技術(shù)上已經(jīng)比較成熟，但鑒于供

2、體來源少、免疫抑制治療時間長以及治療費用高昂等原因，使心臟移植不可能成為常規(guī)的治療方案。在此背景下，細胞治療和基因治療急性缺血性心臟病逐漸成為臨床研究的熱點[2]。
　　 骨髓間充質(zhì)干細胞(Bone Marrow Mesenchymal Stem Cell，BMMSC)屬于骨髓基質(zhì)干細胞，是骨髓中的具有自我更新能力的多潛能細胞，在一定條件下，能分化成多種功能細胞。具有容易獲取，易于培養(yǎng)擴增，低免疫原性，多次傳代后生物學(xué)特性穩(wěn)定，

3、無倫理道德問題等優(yōu)勢，在細胞治療領(lǐng)域有廣闊的臨床應(yīng)用前景。同時，BMMSC可作為載體細胞，接受多種基因轉(zhuǎn)染并在體內(nèi)分化后仍能保持較良好的生物學(xué)特性，使轉(zhuǎn)染基因能穩(wěn)定而持續(xù)的表達，以達到治療的目的；而外源性基因在BMMSC中的表達也有利于增強其移植效應(yīng)及提高其分化率[15]。由此，我們假設(shè)能將Shh基因轉(zhuǎn)入BMMSC中，在確定表達穩(wěn)定后，再把攜帶外源性Shh基因的BMMSC移植到急性心肌梗死區(qū)，這樣基因治療和細胞治療就有可能起到二者相互協(xié)

4、同、相互促進的作用，其效果可能優(yōu)于單用。
　　 本實驗分為兩個部分：第一部分(Shh基因轉(zhuǎn)染BMMSC)，以淋巴細胞分離液法獲取Wistar大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞，利用Amaxa的Nucleofector核轉(zhuǎn)染儀將Shh外源性基因轉(zhuǎn)染入大鼠BMMSC，并檢測基因表達情況；第二部分(Shh基因轉(zhuǎn)染的BMMSC移植對大鼠心功能的影響)，結(jié)扎大鼠左冠狀動脈前降支制作大鼠急性心肌梗死模型，于模型制作成功后在梗死區(qū)直接注射移植攜帶Shh基因

5、的BMMSC，然后在注射移植后第1、2、4、8周分別檢測心功能等指標(biāo)，以此來判斷其治療效果。
　　 第一部分：Shh基因轉(zhuǎn)染BMMSC
　　 目的：探討Shh基因轉(zhuǎn)染BMMSC可行性。
　　 方法：1.采用淋巴細胞分離液法獲取Wistar大鼠的BMMSC。繪制其生長曲線，檢測BMMSC表面標(biāo)志物CD34、CD44、CD45和SH3。2.利用Amaxa的Nucleofector核轉(zhuǎn)染儀轉(zhuǎn)染pcDNA3.1(-)-S

6、hh進入BMMSC，觀察轉(zhuǎn)染后BMMSC的形態(tài)和生長狀況的變化，鑒定Shh基因的表達情況。
　　 結(jié)果：1.采用淋巴細胞分離液法可以成功分離大鼠BMMSC，以此為基礎(chǔ)口了以建立穩(wěn)定的BMMSC培養(yǎng)體系。2.Western blot檢測證實利用Amaxa的Nucleofector核轉(zhuǎn)染儀能有效的將Shh基引轉(zhuǎn)染至大鼠BMMSC中，并獲得穩(wěn)定的表達。
　　 結(jié)論：外源性Shh基因通過Nucleofector核轉(zhuǎn)染儀轉(zhuǎn)染BMM

7、SC后可以穩(wěn)定表達，為后續(xù)研究Shh基因轉(zhuǎn)染BMMSC移植對大鼠急性心肌梗死后心臟功能的影響等提供了基礎(chǔ)。
　　 第二部分：Shh基因轉(zhuǎn)染骨髓間充質(zhì)干細胞移植對大鼠心功能影響
　　 目的：探討大鼠急性心肌梗死模型的制作，Shh基因轉(zhuǎn)染BMMSC后的注射移植方法以及移植后心功能等指標(biāo)的變化，并比較與基因治療和/或細胞治療的療效差別。
　　 方法：以冠脈結(jié)扎法制作近交系Wistar大鼠急性心肌梗死模型，200只急性心

8、肌缺血模型動物隨機分為5組(每組40只)。轉(zhuǎn)基因組(Transfection group，T)在急性心梗模型建立后立即在心肌梗死區(qū)移植轉(zhuǎn)染Shh基因的BMMSC，細胞組(BMMSC group，B)在心肌梗死區(qū)移植等量的BMMSC，基因組(Gene group，G)在心肌梗死區(qū)注射pcDNA3.1-Shh DNA，混合組(Mixed group，M)在心肌梗死區(qū)注射等量BMMSC和pcDNA3.1-Shh DNA的混合物，對照組(Con

9、trolgroup，C)在心肌梗死區(qū)注射等容積的低糖DMEM液。分別于移植后第1、2、4、8周以BHXCO XA(Biosystem XA)系統(tǒng)檢測大鼠在體心功能，并行免疫組化、電鏡檢測確定移植細胞的存活及分化。
　　 結(jié)果：結(jié)扎大鼠左冠狀動脈前降支制作的急性心梗模型，制作成功率約為80％。移植治療1，2周后，Buxco檢測心功能顯示轉(zhuǎn)基因組LVSP、+dp/dt有高于對照組的趨勢，但尚不足以提示有顯著差異。移植治療4周后，轉(zhuǎn)基