冠脈結(jié)合多次靜脈移植間充質(zhì)干細(xì)胞治療慢性缺血性心臟病的實驗研究.pdf

1、缺血性心臟病(ischemic heart disease，IHD)是威脅人類健康的主要殺手之一，具有極高的致死率和致殘率。盡管多數(shù)患者能從經(jīng)皮冠狀動脈腔內(nèi)血管成形術(shù)(percutaneous transluminal coronary angioplasty，PTCA)、冠狀動脈搭橋手術(shù)(coronary artery bypass graft，CABG)及藥物治療中獲益，但仍然有相當(dāng)數(shù)量的慢性缺血性心臟病(chronic ische

2、mic heart disease，CHD)患者，他們因為冠脈病變嚴(yán)重、彌漫等各種原因無法進行手術(shù)治療，且藥物治療效果往往不理想。這部分CHD患者目前缺乏有效的干預(yù)措施，臨床上也被稱作“無選擇權(quán)”患者。
　　干細(xì)胞研究的進展為這類患者帶來了希望。近年來，大量基礎(chǔ)口臨床研究顯示，干細(xì)胞移植可以減少心肌細(xì)胞凋亡，促進新生血管形成，改善心室重構(gòu)，提高心功能，顯示出良好的應(yīng)用前景。其中間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stemcell

3、s，MSCs)因其來源廣泛，操作簡便，具有免疫豁免效應(yīng)等優(yōu)勢而受到研究人員的廣泛青睞。現(xiàn)有的研究表明，MSCs治療急性心肌缺血安全有效。但MSCs在治療慢性心肌缺血方面的研究尚少。目前，國內(nèi)外尚未見到在大動物模型上研究聯(lián)合移植MSCs治療CHD的報道。MSCs有多種來源，現(xiàn)有的研究多采用骨髓來源間充質(zhì)干細(xì)胞(BM-MSCs)。但BM-MSCs具有取材有創(chuàng)傷，年齡較大供體的MSCs增殖能力有限等缺點。因此，研究人員開始探討多種其他來源MS

4、Cs治療心臟病的可行性。其中臍帶來源間充質(zhì)干細(xì)胞(UC-MSCs)因其取材無創(chuàng)傷，無倫理限制，細(xì)胞增殖和分化能力強，能分泌多種促血管生成因子等優(yōu)勢，成為替代BM-MSCs的較為理想的細(xì)胞來源。目前已經(jīng)有大量采用UC-MSCs治療多種疾病的臨床前或臨床研究報道，包括肝硬化、糖尿病、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、移植物抗宿主病(graft-versus-host disease，GVHD)等，但在心臟病的研究方面尚處于起步階段。目前尚未見到采用UC-MS

5、Cs治療CHD的研究報道。
　　因此，本研究擬建立豬慢性缺血性心臟病動物模型，通過冠脈結(jié)合兩次靜脈輸注的方式移植異體豬骨髓來源間充質(zhì)干細(xì)胞(pig bone marrow-derivedmesenchymal stem cells，pBM-MSCs)和人臍帶來源間充質(zhì)干細(xì)胞(human umbilicalcord-derived mesenchymal stem cells，hUC-MSCs)進行干預(yù)，采用冠脈造影、心臟超聲、單光

6、子發(fā)射計算機斷層成像(single-photon emission computedtomography，SPECT)和病理組織學(xué)等方法綜合評價骨髓和臍帶來源MSCs移植對CHD的治療作用，從而為今后的臨床應(yīng)用提供依據(jù)。
　　本研究首先采用Ficoll密度梯度法分離pBM-MSCs，相差顯微鏡觀察顯示，pBM-MSCs呈梭形，旋渦狀或魚尾狀生長。流式檢測結(jié)果表明，pBM-MSCs表達(dá)CD44、CD29、CD90，而CD14、CD3

7、4、CD45、CD166、HLA-DR表達(dá)呈陰性。誘導(dǎo)分化實驗發(fā)現(xiàn)，pBM-MSCs能夠分化為脂肪細(xì)胞、成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞。
　　然后我們采用酶消化法分離hUC-MSCs，相差顯微鏡下觀察，細(xì)胞呈梭形，旋渦狀或平行排列，流式檢測結(jié)果顯示，細(xì)胞表達(dá)CD29、CD44、CD73、CD90、CD105和HLA-ABC，而CD34、CD45、HLA-DR表達(dá)呈陰性。誘導(dǎo)分化結(jié)果顯示，hUC-MSCs可向脂肪細(xì)胞、成骨細(xì)胞和軟骨細(xì)胞的分化。

8、
　　最后我們著重探討了pBM-MSCs和hUC-MSCs對慢性缺血性心臟病大動物模型的治療作用。選取30只小型豬，將Ameroid動脈縮窄環(huán)置于豬左冠回旋支(left circumflex coronary artery，LCX)建立慢性缺血性心臟病動物模型，4周后通過冠脈造影和心電圖對模型進行評價;存活的20只動物隨機分為pBM-MSCs組(n=8)、hUC-MSCs組(n=6)和對照組(n=6)，治療組采用冠脈結(jié)合兩次靜脈輸

9、注的方式移植經(jīng)過CM-DiI標(biāo)記的pBM-MSCs和hUC-MSCs進行干預(yù)，對照組則輸注生理鹽水。細(xì)胞移植前和移植后4周，冠脈造影檢測冠脈側(cè)枝循環(huán)，心臟超聲檢測心功能和心臟結(jié)構(gòu)指標(biāo)，SPECT檢測心肌血流灌注。動物處死后取心臟行2，3，5-氯化三苯基四氮唑(2，3，5-triphenyl-2H-tetrazolium chloride，TTC)染色計算梗死面積，并選取梗死邊緣區(qū)的組織制備病理切片，檢測心肌細(xì)胞纖維化、凋亡、新生血管形成

10、等情況，并觀察移植細(xì)胞的植入和轉(zhuǎn)歸。
　　建模后4周，存活的20只豬冠脈造影顯示LCX均完全閉塞，心電圖可見Ⅰ、AVL和（或）Ⅱ、Ⅲ、AVF和(或)V4-V6導(dǎo)聯(lián)ST段壓低和（或）T波改變。
　　細(xì)胞移植后4周，冠脈造影結(jié)果顯示:對照組和細(xì)胞治療組均有側(cè)枝血管形成，但與治療前相比，對照組Rentrop評分增加無統(tǒng)計學(xué)意義，而pBM-MSCs組和hUC-MSCs組結(jié)果則有顯著差異(p＜0.01)，表明細(xì)胞移植促進了側(cè)枝循環(huán)的形

11、成;與對照組相比，pBM-MSCs組和hUC-MSCs組側(cè)枝血管計數(shù)結(jié)果有顯著差異(P＜0.05)，但兩個細(xì)胞治療組之間無明顯差別。心電圖結(jié)果表明，pBM-MSCs和hUC-MSCs移植組心率(heart rate，HR)較治療前無明顯變化，而對照組HR明顯增加(P＜0.01)。心臟超聲:細(xì)胞治療組的左室射血分?jǐn)?shù)(Leftventricular ejection fraction，LVEF)較治療前均有升高，pBM-MSCs組從53.9

12、1％±6.72％升至58.19±7.10％(p＜0.05)，hUC-MSCs組從56.12±2.86％升至61.32±3.23％(p＜0.05)，而對照組的LVEF較治療前下降;與對照組相比，細(xì)胞治療組LVEF的升高具有顯著差異(P＜0.05)，但pBM-MSCs組與hUC-MSCs組間相比無差異;與對照組相比，兩個細(xì)胞治療組的梗死區(qū)收縮期室壁增厚率(systolicthickening fraction in the infarcte

13、d left ventricular wall，WThF)升高均有統(tǒng)計學(xué)差異(P＜0.05);此外，對照組的左室收縮末期容積(left ventricular end-systolic volume，LVESV)和左室舒張末期容積(left ventricular end-diastolic volume，LVEDV)較治療前均明顯增大(P＜0.05)，而pBM-MSCs組和hUC-MSCs組治療前后未見明顯改變。SPECT結(jié)果顯示:對

14、照組和細(xì)胞治療組心肌血流灌注均較治療前有所改善;但pBM-MSCs組(p＜0.01)和hUC-MSCs組(p＜0.05)改善較對照組明顯，且二者之間無顯著差異。
　　病理組織學(xué)結(jié)果顯示，TTC染色:pBM-MSCs組和hUC-MSCs組梗死面積分別為7.89±2.62％和8.35±1.88％，比對照組(14.52±4.85％)顯著減小(p＜0.05);HE染色:細(xì)胞移植組炎性評分顯著低于對照組(p＜0.05); Masson三色染

15、色顯示細(xì)胞移植組的膠原容積分?jǐn)?shù)(collagen volume fraction，CVF)明顯小于對照組(p＜0.05);血管計數(shù):pBM-MSCs和hUC-MSCs移植組微血管密度顯著高于對照組(p＜0.05); TUNEL(terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP nick end labeling)法檢測凋亡，pBM-MSCs組(11±3cells/100 cells)和hUC-MSCs

16、組(13±4 cells/100cells)凋亡的心肌細(xì)胞數(shù)量明顯少于對照組(24±3 cells/100 cells)(p＜0.01)。熒光顯微鏡下梗死邊緣區(qū)可見有CM-DiI標(biāo)記的細(xì)胞，免疫熒光染色顯示pBM-MSCs組和hUC-MSCs組均可見移植后的MSCs部分分化為血管內(nèi)皮細(xì)胞，未觀察到其向心肌細(xì)胞分化。RT-qPCR顯示，與對照組相比，pBM-MSCs組的促血管生成素(angiogenin，Ang)表達(dá)增高(p＜0.05)，

17、hUC-MSCs組的Ang(p＜0.01)和血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)(p＜0.05)表達(dá)增高，而白介素-6(interleukin-6，IL-6)、成纖維細(xì)胞生長因子(fibroblast growth factor,FGF)、胸腺肽β4(thymosin beta4，Tβ4)的表達(dá)無顯著改變。
　　本研究成功分離培養(yǎng)了pBM-MSCs和hUC-MSCs;并