骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞治療大鼠脊髓損傷移植途徑的實驗研究.pdf

1、目的：通過損傷局部直接注射法、股靜脈注射法和腰椎穿刺法三種途徑移植骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞到大鼠脊髓損傷部位，觀察骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞對脊髓損傷大鼠神經(jīng)功能恢復(fù)的影響，并比較、篩選適用于臨床應(yīng)用的移植途徑。
　　 方法：
　　 1．取4只6周齡、體質(zhì)量120-140g的健康SD大鼠，采用全骨髓貼壁法分離培養(yǎng)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，經(jīng)過傳代、擴增至第五代行流式細(xì)胞儀鑒定。在細(xì)胞移植前48小時進行Brdu標(biāo)記，倒置相差顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)。<

2、br>　　 2.48只SD大鼠采用改良Allen's打擊法建立T10脊髓損傷模型，成功造模3天后隨機分為四組。A組：模型對照組不行細(xì)胞移植；B組：直接注射組在脊髓損傷部位上下位點注射骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞至損傷大鼠體內(nèi)；C組：通過股靜脈將骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植到損傷大鼠體內(nèi)；D組：通過腰椎穿刺將骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植到損傷大鼠體內(nèi)。在細(xì)胞移植后3、7、14、21天四個時間點進行觀察。
　　 3．用運動神經(jīng)功能BBB評分觀察大鼠后肢功能狀

3、態(tài)恢復(fù)的情況。
　　 4．在各時間點取大鼠脊髓組織，觀察損傷區(qū)病理學(xué)改變，并用免疫組化的方法檢測各組Brdu陽性細(xì)胞、Brdu+GFAP、Brdu+NF-200雙染陽性細(xì)胞，用專業(yè)圖像分析軟件計算各組GFAP、NF-200表達的平均光密度值。
　　 5．統(tǒng)計學(xué)處理：實驗數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差記錄，使用統(tǒng)計學(xué)SPSS16.0軟件進行單因素方差分析，以P＜0.05差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　 結(jié)果：
　　 1．通過全

4、骨髓貼壁法分離、培養(yǎng)的大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在體外進行傳代、擴增，第五代細(xì)胞形態(tài)呈長梭形，漩渦狀排列，并且經(jīng)過流式細(xì)胞儀檢測證實分離培養(yǎng)的細(xì)胞為骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞。
　　 2．A、B、C、D四組大鼠后肢運動功能逐漸恢復(fù)，在細(xì)胞移植7、14、21天后B、C、D三組的運動功能BBB評分較A組明顯增高，而且B組評分高于C、D兩組(P＜0.01)，D組運動功能評分高于C組(P＜0.01)。
　　 3．HE染色結(jié)果顯示，模型對照組脊髓

5、組織有較多壞死區(qū)域，神經(jīng)元大量壞死，空泡較多，間質(zhì)水腫明顯，而其它三個實驗組的壞組織死較小，空泡少，間質(zhì)水腫較輕。
　　 4．B、C、D三組在細(xì)胞移植后均發(fā)現(xiàn)Brdu標(biāo)記的陽性細(xì)胞，各時間點的B組細(xì)胞數(shù)目要顯著多于C、D兩組(P＜0.01)，而且經(jīng)腰椎穿刺移植的D組陽性細(xì)胞數(shù)要多于經(jīng)股靜脈移植的C組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。在細(xì)胞移植后14天可以看到Brdu+GFAP雙染陽性的細(xì)胞，而Brdu+NF-200雙染陽性細(xì)胞出現(xiàn)在移植后2

6、1天，而且數(shù)量很少。使用專業(yè)圖像軟件分析得出：在細(xì)胞移植后GFAP和NF-200的平均光密度值都有增加，B、C、D三組與A組的差異具有統(tǒng)計學(xué)意義，而且三個實驗組之前也有差異，B組的值高于C、D兩組，D組要高于C組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。
　　 結(jié)論：
　　 1．用全骨髓貼壁法可以在體外分離和培養(yǎng)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞；
　　 2．直接注射、股靜脈注射和腰椎穿刺三種途徑移植的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞均可在脊髓損傷處存