臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞不同移植方式治療脊髓損傷的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：
　　 本課題主要是探討:
　　 1、從人臍帶中分離出間充質(zhì)干細(xì)胞并且能進(jìn)行穩(wěn)定的體外傳代培養(yǎng)的方法;2、直接局部移植人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞修復(fù)大鼠脊髓損傷的療效;3、經(jīng)靜脈移植人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞修復(fù)大鼠脊髓損傷的療效及間充質(zhì)干細(xì)胞遷移到SCI部位的情況;4、直接局部移植、靜脈移植兩種途徑移植hUC-MSCs修復(fù)脊髓損傷的療效對(duì)比觀察;5、hUC-MSCS修復(fù)脊髓損傷的可能機(jī)制，為臨床治療急性脊髓損傷尋找一種合適的移植

2、方式。
　　 材料和方法：
　　 1、人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的原代培養(yǎng)、傳代與鑒定:
　　 取足月妊娠、健康順產(chǎn)的胎兒臍帶，利用組織塊貼壁法原代培養(yǎng)臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞。一般培養(yǎng)5-6天在倒置顯微鏡下即可見到少量新生的細(xì)胞，12-15天時(shí)以組織塊為中心周圍可見細(xì)胞明顯增多，大體呈漩渦狀或放射狀分布，細(xì)胞形態(tài)細(xì)瘦，類似成纖維樣細(xì)胞。傳代后的hUC-MSCs生長迅速，可以得到大量的臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞。利用流式細(xì)胞儀進(jìn)行鑒定，待

3、細(xì)胞傳到第5代后用Brdu體外標(biāo)記，避光生長三天后消化細(xì)胞成細(xì)胞懸液準(zhǔn)備移植。
　　 2、脊髓損傷打擊模型的制備、分組與移植治療:
　　 80只清潔級(jí)wistar大鼠，雌雄不限，體重200-220g，建立大鼠脊髓損傷模型后隨機(jī)分為5組:空白對(duì)照組（A組，10只）、DMEM局部移植組（B組，15只）、DMEM靜脈移植組（C組，15只）、細(xì)胞局部移植組（D組，20只）、細(xì)胞靜脈移植組（E組，20只）。A組只做損傷，不做任何移

4、植作為空白對(duì)照組;B、C兩組大鼠分別通過局部、靜脈移植與細(xì)胞等量體積的DMEM;D、E兩組大鼠分別通過局部和靜脈途徑移植人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的細(xì)胞懸液。
　　 3、脊髓損傷功能恢復(fù)的評(píng)價(jià):
　　 術(shù)后通過第1天、1周、2周、3周、4周、6周、8周、10周和12周動(dòng)物模型的BBB評(píng)分來觀察大鼠后肢功能恢復(fù)的情況。術(shù)后定期隨機(jī)取大鼠脊髓標(biāo)本，先行大體形態(tài)學(xué)觀察，再行HE染色和嗜銀染色，觀察脊髓損傷周圍空洞形成情況以及神經(jīng)軸突的

5、再生情況。免疫熒光觀察hUC-MSCS在損傷局部存活、遷移、分化情況;通過免疫組化染色技術(shù)來檢測(cè)膠質(zhì)纖維酸性蛋白(GFAp)的多少，比較各組損傷局部膠質(zhì)癱痕形成面積的大小。
　　 結(jié)果：
　　 BBB評(píng)分:D、E組于損傷后3周評(píng)分分別達(dá)7.20±0.70，7.12±0.81，明顯高于A、B、C等其他各組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.05)，而其D、E組組間差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＞0.05)，A、B、C組組間差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意

6、義(p＞0.05)。術(shù)后1d、1、2周各組結(jié)果之間沒有顯著性差異(P＞0.05);術(shù)后4周、6周、8周、10周、12周，D、E組均與ABC組存在顯著性差異(P＜0.05)，D、E組組間差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＞0.05)，A組、B組、C組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。
　　 HE染色和嗜銀染色見D組、E組均有較多的再生軸突，部分再生神經(jīng)纖維通過損傷區(qū)，D、E組再生軸突的數(shù)量無明顯差異;而A組、B組和C組僅有極少散在的再生軸

7、突，無連續(xù)性的神經(jīng)纖維通過脊髓損傷區(qū)。免疫組織化學(xué)染色顯示hUC-MSCs移植入大鼠體內(nèi)后可在損傷局部存活并向損傷局部遷移;但是并沒有檢測(cè)到向神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞分化;損傷后3周，E組大鼠損傷局部即可見hUC-MSCs，并且損傷后12周局部仍可見少量的移植細(xì)胞。免疫熒光檢測(cè)見D組、E組損傷周圍星形膠質(zhì)細(xì)胞的形態(tài)趨于正常，不僅排列規(guī)則，而且大量星形膠質(zhì)細(xì)胞通過損傷區(qū)，兩組形成的膠質(zhì)癱痕面積較A組、B組、C組減少。
　　 結(jié)論：