人臍帶間充質干細胞治療肝臟疾病的實驗研究.pdf

1、第一部分
　　 背景：地塞米松是糖皮質激素類藥物，常被用來促進間充質干細胞的成骨、成脂、成軟骨分化。最近，地塞米松也應用于間充質干細胞的體外擴增培養(yǎng)，尤其是骨髓來源的間充質干細胞。而且，亦有研究顯示地塞米松能減少細胞的凋亡。因此，需要系統(tǒng)地研究地塞米松對間充質干細胞基本細胞生物學的影響。另外，雖然很多實驗數(shù)據(jù)都證明間充質干細胞對某些疾病的有效性，但是間充質干細胞的生物安全性也需要明確。所以，本實驗也初步探討了臍帶來源的間充質干細

2、胞的生物安全性。
　　 目的：由于具有獨特的器官修復功能和免疫調節(jié)功能，MSC廣泛應用于各種疾病的治療研究。但是MSC在體外不容易擴增，常常需要添加地塞米松來促進細胞的增殖。因此，需要系統(tǒng)地研究和比較地塞米松對MSC的基本細胞生物學特性的影響。另外，也需要初步探討MSC的安全性。
　　 方法：從人臍帶中獲取MSC，并對MSC做出鑒定，包括流式細胞儀檢測細胞表型和分化。然后經(jīng)過不同濃度的地塞米松培養(yǎng)2周后，收獲MSC細胞，

3、進行流式細胞儀檢測細胞表型、促增殖實驗、免疫調節(jié)實驗、檢測分泌因子等等。在生物安全性方面，我們檢測了MSC的TP53基因序列、端粒酶反轉錄酶表達測定、細胞核型分析、長期毒性實驗和致瘤性實驗。
　　 結果：我們的實驗結果顯示不同濃度的地塞米松對MSC的作用有差異性。在促增殖和影響凋亡上，高低兩種濃度的地塞米松對MSC的作用剛好出現(xiàn)相反的效果。然而，不管濃度高低，地塞米松都能損壞MSC的免疫調節(jié)能力。高濃度的地塞米松還明顯抑制了MS

4、C分泌HGF。而低濃度的地塞米松則促進了VEGF的分泌。生物細胞安全性方面的實驗沒發(fā)現(xiàn)MSC有毒性及致瘤性。
　　 結論：低劑量的地塞米松能促進MSC的體外擴增，并增強MSC的抗凋亡能力。但是由于地塞米松能損壞MSC的免疫調節(jié)能力，因此，要利用MSC的免疫調節(jié)功能來治療疾病，則不合適在MSC的培養(yǎng)過程中添加地塞米松。低濃度的地塞米松能促進MSC高分泌VEGF，這有利于提高MSC治療促進血管新生類疾病。而且，我們的數(shù)據(jù)也證明了MS

5、C使用的安全性。
　　 第二部分
　　 背景：肝纖維化(liver fibrosis，LF)是所有慢性肝病的共同病理基礎，由肝臟細胞外基質(extracellular matrix，ECM)的過度沉積所致。伴隨著纖維膠原的增多，疤痕組織和增生性結節(jié)代替正常組織，此時進展為肝硬化，導致正常肝功能的衰竭。各種原因引起的肝臟炎癥，或損傷后組織修復過程的代償反應，均可導致肝纖維化的發(fā)生。目前認為纖維化階段的肝臟病變是可逆的，但若

6、沒有得到及時有效的治療，則最終往往導致肝腹水、上消化道出血、肝硬化、肝癌、肝功能衰竭等一系列疾病，是引起人類死亡的主要原因之一。間充質干細胞能分泌多種細胞因子，能促進器官特異性祖細胞的增殖和分化；MSC亦具有能分化為成骨細胞、軟骨細胞、脂肪細胞、心肌細胞、肝細胞等潛能，參與受損組織的再生修復。由此可見，探索研究MSC治療肝纖維化及其作用機制，具有重大意義。
　　 目的：基于MSC的再生修復實質器官和免疫調節(jié)的雙重作用，本項研究旨

7、在研究臍帶MSC抗纖維化機制，期望開發(fā)出一種新型的有效的治療肝纖維化的細胞制劑，為UC-MSC在人肝纖維化及肝硬化的臨床應用提供理論依據(jù)和實驗基礎。
　　 方法：腹腔注射橄欖油稀釋的四氯化碳誘導肝纖維化模型，每3天注射一次，共注射30次。在體內趨化研究實驗中，在造模成功后，將體外CM-DiI熒光標記的人臍帶MSC通過尾靜脈注射移植到體內。24小時后，取肝臟做冰凍切片，免疫熒光顯微鏡檢測CM-DiI熒光強度，并和健康對照組比較。治

8、療組，造模結束后，每周給1次MSC細胞治療，治療3周和6周。取肝臟做HE染色和Masson染色，評價肝細胞和膠原纖維的變化。同時，我們還評價了UC-MSC在體外向肝細胞誘導分化的情況。
　　 結果：UC-MSC分泌高濃度的HGF和MMPs。UC-MSC移植治療肝纖維化模型小鼠后，HE染色和Masson染色均提示，UC-MSC能明顯促進膠原纖維的消退和肝細胞再生，使得硬化的肝臟基質得到正常重建。此外，UC-MSC能在體外能夠分化成

9、為肝細胞，同時具有部分肝細胞和MSC的功能。
　　 結論：人UC-MSC可以有效地逆轉肝纖維化的發(fā)展，并起到良好的抗纖維化治療作用；其作用機制可能與分泌豐富的HGF和MMPs有關。
　　 第三部分
　　 背景：急性肝功能衰竭是在原有肝病的基礎上，肝功能的嚴重損傷或者肝細胞的廣泛性壞死引起的。目前整個肝臟移植治療是最好的治療方法，但是整個肝移植也面臨著一系列問題，肝源不足就是一個瓶頸難題。肝細胞移植治療曾經(jīng)是一個治

10、療手段。然而肝細胞移植的技術難題依然存在，比如肝細胞在體外難于增殖擴增，異體肝細胞引起的免疫排斥反應等等，均限制了臨床的應用。因為探索研究MSC治療急性肝衰竭，其意義重大。
　　 目的：基于MSC的再生修復實質器官和免疫調節(jié)的雙重作用，本項研究旨在研究臍帶MSC治療急性肝功能衰竭，期望開發(fā)出一種新型的有效的治療急性肝衰竭的細胞制劑，為UC-MSC在人急性肝衰竭的臨床應用提供理論依據(jù)和實驗基礎。
　　 方法：聯(lián)合應用D-氨

11、基半乳糖和脂多糖腹腔注射，誘導小鼠發(fā)生急性肝衰竭，觀察在造模后出現(xiàn)死亡的時間和生存率。在造模后，給與MSC移植治療，并觀察不同時間點和不同劑量對急性肝衰竭小鼠的生存率的影響。
　　 結果：D-氨基半乳糖和脂多糖聯(lián)合應用能成功誘導小鼠急性肝衰竭，大概在造模后8-10小時內，大部分小鼠開始出現(xiàn)死亡。MSC的治療能提高造模小鼠的生存率，但療效和治療時間密切相關。
　　 結論：人UC-MSCs可以有效地治療急性肝衰竭小鼠，挽救了