誘導人臍帶間充質(zhì)干細胞向角膜上皮樣細胞分化的實驗研究.pdf

1、目的：
　　研究人臍帶間充質(zhì)干細胞（human umbilical cord-derived mesenchymal stem cells，hUCMSCs）向角膜上皮樣細胞分化的可行性研究。
　　方法：
　　1.IV型膠原酶消化法分離培養(yǎng)人臍帶間充質(zhì)干細胞(hUCMSCs)，對其進行形態(tài)學觀察。并通過細胞表型和多潛能誘導分化鑒定 hUC-MSCs。2.分別采用胰酶消化法和組織塊貼壁法獲取兔角膜上皮細胞（corneal

2、epithelial cells RECEs），倒置顯微鏡觀察其形態(tài)和生長狀態(tài)，CCK8法測定RECEs的增殖活性，免疫熒光檢測其角膜上皮細胞特異性角蛋白CK3+12的表達。3.將臍帶間充質(zhì)干細胞與兔角膜上皮細胞通過Transwell體系進行隔離共培養(yǎng)7天，誘導過程中倒置顯微鏡和原子力顯微鏡對比觀察 hUC-MSCs形貌的改變；qRT-PCR檢測誘導前后人臍帶間充質(zhì)干細胞CK3mRNA,PAX6mRNA表達量的變化；免疫熒光檢測角蛋白抗

3、體CK3+12,CK14,CK19,PNCA的表達。設定共培養(yǎng)組為實驗組，常規(guī)培養(yǎng)hUC-MSCs為對照組。
　　結果：
　　HUCMSCs形態(tài)比較均一，呈典型的梭形和成纖維形；hUCMSCs高表達間充質(zhì)干細胞表型CD13、CD29、CD73、CD90，不表達內(nèi)皮細胞和造血細胞表型CD14、CD31、CD45、HLA-DR；特定的條件培養(yǎng)液下，hUC-MSCs成功向成骨成脂定向分化。RECEs呈類圓形、多邊形；增殖快，融合后

4、呈鋪路石樣外觀；CCK8法測定RECEs的生長曲線呈S形；免疫組化檢測RECEs表達角膜上皮細胞特異性角蛋白CK3+12。HUC-MSCs與RECEs共培養(yǎng)誘導七天后，倒置顯微鏡下體積變大，核漿比變??；原子力顯微鏡下觀察hUC-MSCs胞體寬大，胞膜表面立體感減弱；CK3mRNA和PAX6mRNA表達量均比誘導前顯著增加（P<0.05）；免疫熒光檢測 CK3+12，CK14,CK19,PCNA表達陽性。
　　結論：
　　在T