誘導(dǎo)人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞向角膜上皮樣細(xì)胞分化的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：
　　研究人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞（human umbilical cord-derived mesenchymal stem cells，hUCMSCs）向角膜上皮樣細(xì)胞分化的可行性研究。
　　方法：
　　1.IV型膠原酶消化法分離培養(yǎng)人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞(hUCMSCs)，對(duì)其進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察。并通過(guò)細(xì)胞表型和多潛能誘導(dǎo)分化鑒定 hUC-MSCs。2.分別采用胰酶消化法和組織塊貼壁法獲取兔角膜上皮細(xì)胞（corneal

2、epithelial cells RECEs），倒置顯微鏡觀察其形態(tài)和生長(zhǎng)狀態(tài)，CCK8法測(cè)定RECEs的增殖活性，免疫熒光檢測(cè)其角膜上皮細(xì)胞特異性角蛋白CK3+12的表達(dá)。3.將臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞與兔角膜上皮細(xì)胞通過(guò)Transwell體系進(jìn)行隔離共培養(yǎng)7天，誘導(dǎo)過(guò)程中倒置顯微鏡和原子力顯微鏡對(duì)比觀察 hUC-MSCs形貌的改變；qRT-PCR檢測(cè)誘導(dǎo)前后人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞CK3mRNA,PAX6mRNA表達(dá)量的變化；免疫熒光檢測(cè)角蛋白抗

3、體CK3+12,CK14,CK19,PNCA的表達(dá)。設(shè)定共培養(yǎng)組為實(shí)驗(yàn)組，常規(guī)培養(yǎng)hUC-MSCs為對(duì)照組。
　　結(jié)果：
　　HUCMSCs形態(tài)比較均一，呈典型的梭形和成纖維形；hUCMSCs高表達(dá)間充質(zhì)干細(xì)胞表型CD13、CD29、CD73、CD90，不表達(dá)內(nèi)皮細(xì)胞和造血細(xì)胞表型CD14、CD31、CD45、HLA-DR；特定的條件培養(yǎng)液下，hUC-MSCs成功向成骨成脂定向分化。RECEs呈類圓形、多邊形；增殖快，融合后

4、呈鋪路石樣外觀；CCK8法測(cè)定RECEs的生長(zhǎng)曲線呈S形；免疫組化檢測(cè)RECEs表達(dá)角膜上皮細(xì)胞特異性角蛋白CK3+12。HUC-MSCs與RECEs共培養(yǎng)誘導(dǎo)七天后，倒置顯微鏡下體積變大，核漿比變??；原子力顯微鏡下觀察hUC-MSCs胞體寬大，胞膜表面立體感減弱；CK3mRNA和PAX6mRNA表達(dá)量均比誘導(dǎo)前顯著增加（P<0.05）；免疫熒光檢測(cè) CK3+12，CK14,CK19,PCNA表達(dá)陽(yáng)性。
　　結(jié)論：
　　在T