人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞向造血細(xì)胞方向分化的研究.pdf

1、從世界完成首例造血干細(xì)胞移植到現(xiàn)在已經(jīng)有50年的時(shí)間了，這項(xiàng)技術(shù)已經(jīng)成為治療各類惡性血液病的最為有效的方法，每年全球移植病例數(shù)都在增加，接受這項(xiàng)技術(shù)治療的患者最長的無病生存時(shí)間已經(jīng)超過35年了。造血干細(xì)胞的成功植入是HSCT發(fā)揮治療作用的前提，在臨床治療中于宿主HLA不全相合、輸注造血干細(xì)胞數(shù)量不足、移植前大劑量化療致骨髓基質(zhì)損傷嚴(yán)重及移植物抗宿主病發(fā)生均會導(dǎo)致造血干細(xì)胞植入失敗或植入延遲，從而使移植死亡率增加，使得該技術(shù)在實(shí)際應(yīng)用中面

2、臨著很大困難。特別是在一些惡性血液病的治療中，由于長期、多次的輸入異體來源的HSC，極易引發(fā)致死性的肺損傷以及移植后感染。因此，解決HSCT中的HSC的來源以及其安全問題，獲得穩(wěn)定、高效的造血干細(xì)胞或具有造血潛能的細(xì)胞成為進(jìn)一步推廣HSCT的關(guān)鍵，這不僅具有重要的醫(yī)學(xué)意義，而且將產(chǎn)生巨大的社會經(jīng)濟(jì)效益。
　　 以往的觀點(diǎn)認(rèn)為，未分化細(xì)胞分化形成特定類型的終末細(xì)胞這一過程是不可逆的；但近幾年發(fā)育生物和干細(xì)胞技術(shù)的發(fā)展可以成功的將一

3、種類型的組織特異性細(xì)胞轉(zhuǎn)化形成另外一種類型的細(xì)胞。在HSCT的病人中也支持了這些觀點(diǎn)。HSCT數(shù)月后，可以在病人的骨髓或者造血組織中發(fā)現(xiàn)來源于宿主的表皮細(xì)胞、肝細(xì)胞，甚至還出現(xiàn)了消化管上皮細(xì)胞等。這些結(jié)果表明在體內(nèi)環(huán)境中的人體干細(xì)胞在分化過程中存在著一定的不確定性。而現(xiàn)在的表觀遺傳學(xué)研究也為終末細(xì)胞之間的互相轉(zhuǎn)化提供了可能。也有實(shí)驗(yàn)表明可以講表皮細(xì)胞或者其他細(xì)胞誘導(dǎo)成為造血系細(xì)胞。如果這些研究成果能夠成熟并且得以應(yīng)用，將解決上面提到的H

4、SCT中出現(xiàn)的問題。間充質(zhì)細(xì)胞是容易得到的較為幼稚的一類干細(xì)胞，而且具有多向分化潛能，可以在體外容易大量增殖，如果可以將間充質(zhì)細(xì)胞成功誘導(dǎo)形成造血細(xì)胞，探明轉(zhuǎn)化的機(jī)制，將具有廣闊的應(yīng)用前景。
　　 本課題擬以人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞為誘導(dǎo)前體細(xì)胞，采用貼壁法和酶消化法獲得原代細(xì)胞，純化后再分選出較為均一的有多系分化潛能的多能干細(xì)胞群，經(jīng)過化學(xué)誘導(dǎo)的方法，改變其表觀遺傳學(xué)表達(dá)，對誘導(dǎo)后細(xì)胞進(jìn)行形態(tài)、免疫學(xué)和造血功能等方面的檢測，探討其向

5、造血細(xì)胞方向分化的可行性。進(jìn)一步研究細(xì)胞分化過程中MiRNA的表達(dá)變化，分析誘導(dǎo)后細(xì)胞內(nèi)表觀遺傳學(xué)變化的方式和方法。與成體來源，如骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞相比，hUMSCs的幼稚程度更低，HLA抗原表達(dá)更弱，其擴(kuò)增和多向分化能力也較強(qiáng)；與HSC相比，兩者都屬于來源于胚外中胚層的間充質(zhì)組織，所以從理論上具有轉(zhuǎn)化的可能。以往在HSCT中MSC一直作為輔助使用細(xì)胞，但是如果能夠穩(wěn)定的將MSC誘導(dǎo)形成HSC，將解決HSCT中存在的來源不穩(wěn)定和異體移植的

6、問題，在臨床上發(fā)揮不可估量的作用。
　　 第一部分：人UMSCs的分離培養(yǎng)與鑒定
　　 方法：
　　 (1)分別采用貼塊法和酶消化法獲得原代培養(yǎng)的hUMSCs，傳代純化后進(jìn)行克隆化培養(yǎng)，培育出形態(tài)和增殖能力較為單一的細(xì)胞克隆。
　　 (2)光鏡及電鏡觀察hUMSCs克隆化后的形態(tài)學(xué)特點(diǎn)。
　　 (3)取第4代(P4)的hUMSCs進(jìn)行免疫細(xì)胞熒光化學(xué)染色和流式細(xì)胞儀檢測間充質(zhì)干細(xì)胞的標(biāo)志性分子：V

7、imentin、α-SMA、Oct-4、Sox-2、HLA-1、CD29、CD34、CD133、CD44和CD45。
　　 (4)取P4hUMSCs進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期DNA含量。 (5)對克隆化hUMSCs進(jìn)行體外細(xì)胞誘導(dǎo)分化，鑒定其脂肪與成骨細(xì)胞方向分化的潛能。
　　 結(jié)果：
　　 原代培養(yǎng)7d后可見培養(yǎng)瓶中有克隆樣生長的細(xì)胞團(tuán)，經(jīng)過單一細(xì)胞的克隆化傳代培養(yǎng)后：
　　 (1)形態(tài)上呈梭形或紡錘形

8、，胞漿豐富；透射電鏡顯示，克隆化P4hUMSCs細(xì)胞核內(nèi)異染色質(zhì)較少，核仁明顯。
　　 (2)表面標(biāo)志分子上，免疫熒光細(xì)胞化學(xué)檢測顯示，P4hUMSCs均表達(dá)間質(zhì)細(xì)胞骨架蛋白Vimentin、早期平滑肌細(xì)胞表面標(biāo)志物α-SMA、全能性轉(zhuǎn)錄因子Oct4和Sox2、間充質(zhì)干細(xì)胞表面抗原CD29和CD44、其中23％的細(xì)胞表達(dá)CD133、5％細(xì)胞表達(dá)HLA-1、)。5％的細(xì)胞表達(dá)CD34和CD44。
　　 (3)細(xì)胞周期分析上

9、，hUMSCs85％以上細(xì)胞是處于靜止期，即G0/G1期，S+G2+M的細(xì)胞平均約占13％，符合干細(xì)胞細(xì)胞周期的特點(diǎn)。
　　 (4)單個(gè)細(xì)胞來源的P4hUMSCs在體外具有向骨細(xì)胞和脂肪細(xì)胞等終末細(xì)胞分化的潛能。
　　 結(jié)論：
　　 (1)我們所獲得的hUMSCs具備了間充質(zhì)干細(xì)胞的大部分標(biāo)記，而且CD133陽性率較高表明其中相對幼稚細(xì)胞數(shù)量較多，HLA-1陽性率較低表明源于臍帶組織的干細(xì)胞其免疫標(biāo)記較弱，更適用

10、于干細(xì)胞移植過程。
　　 (2)hUMSCs可以向脂肪細(xì)胞和成骨細(xì)胞分化，表明其具有多向分化的潛能。
　　 第二部分：化學(xué)誘導(dǎo)hUMSCs向造血細(xì)胞方向分化
　　 方法：
　　 (1)hUMSCs向造血細(xì)胞方向體外分化誘導(dǎo)模型的建立：設(shè)立5-Aza與造血生長因子GF共同誘導(dǎo)為實(shí)驗(yàn)組，GF誘導(dǎo)和為誘導(dǎo)組為對照組。實(shí)驗(yàn)用基本培養(yǎng)基為甲基纖維素化培養(yǎng)基，誘導(dǎo)濃度設(shè)定在2.5μg/ml5-Aza，50ng/mlG

11、M-CSF和SCF，設(shè)定誘導(dǎo)后1d、3d、5d、7d和10d的不同觀測時(shí)間，盡可能提高CD34的陽性細(xì)胞比例。
　　 (2)對誘導(dǎo)后細(xì)胞進(jìn)行表面標(biāo)記的檢測：顯微鏡觀察誘導(dǎo)后細(xì)胞形態(tài)以及超微形態(tài)結(jié)構(gòu)的改變；流式細(xì)胞儀檢測表面標(biāo)記分子，包括CD34、CD45、CD133、CD11b、CD44和CD29；免疫熒光檢測細(xì)胞形態(tài)改變時(shí)細(xì)胞表達(dá)Hoxb4與Vimintin的情況；PCR反應(yīng)檢測細(xì)胞內(nèi)造血相關(guān)信號分子Hoxb4、Scl-1、W

12、nt3a和Gata2。
　　 (3)對誘導(dǎo)后細(xì)胞進(jìn)行造血功能的檢測：利用經(jīng)典脾集落實(shí)驗(yàn)，將誘導(dǎo)后的hUMSCs注射進(jìn)入接收致死劑量照射的裸鼠體內(nèi)，15d后檢測裸鼠的血常規(guī)、脾臟切片。
　　 結(jié)果：
　　 (1)隨著誘導(dǎo)時(shí)間延長，5-Aza/GF聯(lián)合誘導(dǎo)組中細(xì)胞懸浮于培養(yǎng)基中，呈現(xiàn)出集落樣生長的形態(tài)。透射電鏡觀察，細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞器數(shù)量減少，細(xì)胞形態(tài)核質(zhì)比進(jìn)一步增大，核內(nèi)染色質(zhì)分布與造血細(xì)胞類似。
　　 (2)細(xì)

13、胞表面標(biāo)記檢測：CD34、CD45和CD133細(xì)胞陽性比例隨著誘導(dǎo)時(shí)間延長而逐漸升高，CD29和CD44卻逐漸下降。對誘導(dǎo)5d后的細(xì)胞鋪片進(jìn)行免疫熒光檢測，其中部分形態(tài)變圓的細(xì)胞核內(nèi)已經(jīng)高表達(dá)Hoxb4，而仍為梭形的細(xì)胞其胞質(zhì)內(nèi)仍表達(dá)Vimintin；同時(shí)，PCR檢測造血信號表達(dá)可見Hoxb4、Scl-1、Wnt3a和Gata2的表達(dá)均隨著誘導(dǎo)天數(shù)的增加而增加。
　　 (3)造血功能檢測：脾集落實(shí)驗(yàn)后，采集小鼠外周血，血常規(guī)分析

14、接種5-Aza/GF聯(lián)合誘導(dǎo)細(xì)胞組中的粒細(xì)胞升高較為明顯，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；通過對小鼠脾臟切片染色分析，可見組織中有大量細(xì)胞表達(dá)HLA-1。
　　 結(jié)論：
　　 經(jīng)過5-Aza/GF聯(lián)合誘導(dǎo)后的hUMSCs，在形態(tài)上已經(jīng)不具備了間充質(zhì)細(xì)胞的形態(tài)特點(diǎn)，逐漸與成體HSC類似，在表面分子標(biāo)記上，已經(jīng)有很大一部分比例細(xì)胞開始表達(dá)造血干細(xì)胞的特異性分子CD34與CD45，而且更為原始的細(xì)胞標(biāo)記CD133也有所上升，細(xì)胞形態(tài)發(fā)生改變后，

15、參與造血過程的胞內(nèi)重要信號分子Hoxb4表達(dá)大大增多，而且通過脾集落實(shí)驗(yàn)也可以證明誘導(dǎo)后的hUMSCs在體內(nèi)具備了造血重建的功能?？梢?，在5-Aza/GF聯(lián)合誘導(dǎo)作用下，hUMSCs可以朝向造血細(xì)胞方向分化，具備了造血細(xì)胞形態(tài)特征和功能特點(diǎn)。
　　 第三部分：hUMSCs向造血細(xì)胞方向分化過程中相關(guān)MiRNA的變化
　　 方法：
　　 (1)根據(jù)MiRNA文庫預(yù)測以及相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，挑選了miR-126、miR-4

16、51、miR-181a、miR-150和miR-218為主要研究對象，利用primer6.0生物學(xué)軟件設(shè)計(jì)以上5條RNA的逆轉(zhuǎn)錄和Realtime PCR引物。
　　 (2)收集5-Aza/GF聯(lián)合誘導(dǎo)3d、7d和10d的hUMSCs，以單獨(dú)GF誘導(dǎo)為實(shí)驗(yàn)對照，以HSC和hUMSCs為陽性和陰性對照，RNA抽提試劑Trizol裂解收集的細(xì)胞抽提RNA。MMLV逆轉(zhuǎn)錄酶的作用下行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，syberGREEN系統(tǒng)的realtim

17、e PCR反應(yīng)，檢測不同時(shí)間點(diǎn)相關(guān)MiRNA的差異。
　　 (3)挑選表達(dá)差異較大的MiRNA，體外合成相關(guān)MiRNA片段，脂質(zhì)體將其轉(zhuǎn)染進(jìn)入培養(yǎng)的hUMSCs中，24h后RealtimePCR檢測其表達(dá)量的變化，利用甲基纖維素化培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞，1w后收集轉(zhuǎn)染細(xì)胞，Western blot檢測造血相關(guān)因子Hoxb4的表達(dá)，驗(yàn)證該MiRNA在造血分化過程中的作用。
　　 結(jié)果：
　　 (1)Realtime PCR

18、反應(yīng)檢測miR-126、miR-451、miR-181a、miR-150和miR-218等MiRNA，在誘導(dǎo)后的hUMSCs內(nèi)表達(dá)均有所增加，而且隨時(shí)間增加表達(dá)量進(jìn)一步增加，其中以miR-218和miR-451增加較為顯著。
　　 (2)選取miR-218驗(yàn)證其下游功能，將miR-218轉(zhuǎn)染進(jìn)入hUMSCs細(xì)胞內(nèi)，24h后細(xì)胞內(nèi)miR-218表達(dá)升高，證明轉(zhuǎn)染有效。1w后細(xì)胞內(nèi)造血相關(guān)因子HoxB4的表達(dá)量進(jìn)一步升高。
　

19、　 結(jié)論：
　　 hUMSCs向造血細(xì)胞方向分化過程中miR-126、miR-451、miR-181a、miR-150和miR-218表達(dá)量均增高，其中miR-218對造血功能啟動(dòng)具有一定意義。
　　 研究結(jié)論和意義：
　　 1.應(yīng)用化學(xué)誘導(dǎo)的手段進(jìn)行重編程以獲得專能干細(xì)胞。應(yīng)用化學(xué)誘導(dǎo)的方法，設(shè)定多個(gè)濃度和參考條件，為獲得穩(wěn)定的造血細(xì)胞提供了更加可能的條件。
　　 2.從表觀遺傳學(xué)角度探明間充質(zhì)類細(xì)胞