黃連素體外誘導(dǎo)人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞向神經(jīng)樣細(xì)胞分化.pdf

1、目的:對(duì)分離培養(yǎng)的人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞(humanumbilicalcordmesenchymalstemcells,hUMSCs)生物學(xué)特性進(jìn)行鑒定，探討黃連素在體外定向誘導(dǎo)hUMSCs向神經(jīng)細(xì)胞分化中的作用和條件，為定向誘導(dǎo)hUMSCs向神經(jīng)分化以及在臨床上的應(yīng)用提供理論支持和實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
　　 方法:取足月剖宮產(chǎn)健康新生兒臍帶，用D-Hank's充分沖洗，剔除臍動(dòng)脈、臍靜脈，將所剩的臍帶間質(zhì)組織用組織剪切成1mm3大小的組織塊

2、，0.2％膠原酶Ⅱ消化，在含20％胎牛血清(FBS)、2ng/ml表皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子(EGF)、25mM左旋谷氨酰胺(L-Glu)、100U/ml青霉素、100μg/ml鏈霉素的DMEM/F12中培養(yǎng)。觀察提取的原代細(xì)胞的生長(zhǎng)狀況，當(dāng)細(xì)胞融合至80％～90％密度時(shí)，加入0.25％胰酶-1mMEDTA進(jìn)行消化，并傳代。
　　 采用流式細(xì)胞術(shù)對(duì)首次消化后收集的細(xì)胞表型進(jìn)行檢測(cè)，包括CD11b、CD19、CD34、CD45、CD73、C

3、D90、CD105和組織相容性抗原HLA-DR(MHC-Ⅱ)，以抗鼠IgG1-PE和IgG1-FITC作為同型對(duì)照。
　　 原代hUMSCs按比例1∶1傳代后記作P1代，倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)變化及生長(zhǎng)速度，細(xì)胞融合達(dá)到90％以上時(shí)按1∶2或1∶3比例傳代，繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。
　　 取生長(zhǎng)狀態(tài)良好P4代的hUMSCs，分為五組:200μg/ml組、100μg/ml組、50μg/ml組、25μg/ml組和對(duì)照組。以3×1

4、04/孔的密度接種于5個(gè)多聚賴(lài)氨酸包被的六孔板中（每個(gè)六孔板為一組），待細(xì)胞融合達(dá)到70-80％時(shí)，實(shí)驗(yàn)組的四個(gè)六孔板分別換為含有200μg/ml、100μg/ml、50μg/ml、25μg/ml黃連素的無(wú)血清低糖DMEM/F12培養(yǎng)基的誘導(dǎo)液;對(duì)照組六孔板除不加黃連素外，其余均同實(shí)驗(yàn)組。倒置顯微鏡下動(dòng)態(tài)觀察細(xì)胞形態(tài)變化，每12小時(shí)一次，連續(xù)觀察7天，每24h對(duì)各組細(xì)胞進(jìn)行免疫細(xì)胞化學(xué)染色，檢測(cè)其神經(jīng)元標(biāo)志(NSE)、星形膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志(

5、GFAP)和神經(jīng)干細(xì)胞標(biāo)志(Nestin)的表達(dá)情況。各組隨機(jī)選取10個(gè)高倍視野，拍照記錄計(jì)數(shù)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)及細(xì)胞總數(shù)，用以計(jì)算分化率，結(jié)果用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差來(lái)表示。分析不同濃度黃連素誘導(dǎo)hUMSCs的分化率。
　　 結(jié)果:原代細(xì)胞消化、傳代12h后，大部分細(xì)胞貼壁，細(xì)胞呈三角形、菱形、橢圓形、圓點(diǎn)等形態(tài);隨培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)，細(xì)胞逐漸變成均—的長(zhǎng)梭形，數(shù)量增多。培養(yǎng)7-8d時(shí)細(xì)胞融合可達(dá)80％-90％，低倍鏡下看到hUMSCs呈放射狀、漩渦

6、狀排列。按照1∶2的比例再傳代，連續(xù)傳至P15代，hUMSCs仍保持旺盛的增殖能力。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)P3、P5和P10代細(xì)胞表面分子標(biāo)記，結(jié)果顯示各代均表達(dá)CD73、CD90和CD105，而不表達(dá)CD11b、CD19、CD34、CD45和HLA-DR。
　　 加入黃連素誘導(dǎo)液后24h，200μg/ml組和100μg/ml組有個(gè)別細(xì)胞開(kāi)始發(fā)生形態(tài)改變，光學(xué)顯微鏡下可見(jiàn):胞體收縮變圓，折光度增強(qiáng)，伸出指狀突起;50μg/ml組、25μ

7、g/ml組細(xì)胞形態(tài)未見(jiàn)明顯改變。隨著誘導(dǎo)時(shí)間延長(zhǎng)，細(xì)胞胞體進(jìn)一步收縮，突起增長(zhǎng)。36h后部分細(xì)胞出現(xiàn)雙極突起，以200μg/ml組變化最為明顯。48h后200μg/ml、100μg/ml組細(xì)胞突起較前更加細(xì)長(zhǎng)，并可多達(dá)2至5條，有的細(xì)胞突起逐漸發(fā)展成多級(jí)，并彼此接觸交叉，呈神經(jīng)樣網(wǎng)絡(luò)樣結(jié)構(gòu);此時(shí)，50μg/ml組亦可見(jiàn)到少量細(xì)胞胞體收縮、指狀突起形成;25μg/ml組則未見(jiàn)明顯變化。60h后200μg/ml、100μg/ml組內(nèi)相臨細(xì)胞

8、連接形成樹(shù)突樣網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)更加典型，但200μg/ml組內(nèi)出現(xiàn)少量細(xì)胞脫落、漂浮;50μg/ml組中有突起細(xì)胞數(shù)較前亦稍有增多;而25μg/ml組仍未見(jiàn)明顯變化。72h后各組中有形態(tài)變化細(xì)胞的數(shù)量未見(jiàn)到明顯增多。隨誘導(dǎo)液的持續(xù)作用，分化傾向的細(xì)胞表現(xiàn)為越來(lái)越典型的神經(jīng)樣形態(tài)，同時(shí)漂浮、死亡的細(xì)胞也在逐漸增多，以200μg/ml組死亡細(xì)胞數(shù)最多，僅剩少量細(xì)胞存活且細(xì)胞透亮度降低;100μg/ml、50μg/ml組存活的細(xì)胞表現(xiàn)為更為典型的神經(jīng)

9、細(xì)胞樣形態(tài):細(xì)胞胞質(zhì)向胞核收縮，胞體折光增強(qiáng)，形成雙極、多極突起，突起伸長(zhǎng)較前更加明顯，可見(jiàn)2、3級(jí)突起，有的呈放射狀伸展，且直到誘導(dǎo)5天后這些典型神經(jīng)樣細(xì)胞開(kāi)始出現(xiàn)明顯脫落、漂浮。免疫細(xì)胞化學(xué)染色可見(jiàn)大量NSE、GFAP和Nestin陽(yáng)性表達(dá)的神經(jīng)樣細(xì)胞，各標(biāo)志物陽(yáng)性表達(dá)率在不同藥物濃度作用下隨時(shí)間的變化依次為:200μg/ml組NSE(15.0±3.9、81.4±5.8、57.7±7.7、39.1±4.3、25.4±6.8、8.3±

10、4.0、0.0±0.0),GFAP(15.0±4.0、81.3±8.1、56.3±5.6、39.3±5.4、27.1±6.9、8.6±3.2、0.0±0.0),Nestin(14.8±4.0、80.3±7.3、55.9±5.6、38.6±4.9、25.4±6.8、7.9±3.5、0.0±0.0);100μg/ml組NSE(6.4±3.2、50.4±4.7、87.7±4.6、86.6±5.7、85.2±5.0、64.5±6.6、37.2±

11、5.4),GFAP(6.9±3.7、50.8±5.7、87.5±4.0、87.0±5.9、85.3±4.7、66.1±5.0、38.3±4.9)，Nestin(6.3±3.2、50.1±5.0、87.2±4.1、86.6±5.6、84.8±5.3、64.4±6.5、37.3±5.3);50μg/ml組NSE(0.0±0.0、3.6±2.3、14.3±5.3、13.8±4.4、15.6±6.3、15.8±6.5、15.6±5.7),GFA

12、P(0.0±0.0、3.5±3.0、12.4±6.3、13.8±4.7、15.0±4.2、15.2±5.3、15.1±4.1),Nestin(0.0±0.0、2.8±3.3、12.9±6.5、14.5±5.9、14.9±4.8、15.4±5.6、15.2±5.1)。免疫熒光染色同樣呈現(xiàn)GFAP、NSE、Nestin陽(yáng)性表達(dá);對(duì)照組免疫細(xì)胞化學(xué)和免疫熒光染色均呈陰性。
　　 結(jié)論:人臍帶經(jīng)分離純化可得到表達(dá)間充質(zhì)干細(xì)胞表面標(biāo)志CD