人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞分離培養(yǎng)工藝優(yōu)化及體外誘導(dǎo)分化.pdf

1、隨著生命科技突飛猛進(jìn)的發(fā)展和醫(yī)學(xué)知識的不斷普及，臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的臨床意義已經(jīng)得到越來越多人們的認(rèn)可。人臍帶組織中含有大量的間充質(zhì)干細(xì)胞，在用于肝硬化、心血管疾病、骨缺損修復(fù)、脊椎神經(jīng)損傷、肌肉衰退性疾病等疾病的臨床應(yīng)用上具有巨大的應(yīng)用潛力。目前，實(shí)驗(yàn)和臨床應(yīng)用的主要間充質(zhì)干細(xì)胞的細(xì)胞來源是骨髓，但因?yàn)楣撬璐嬖谠S多局限性，例如在采集時需要通過骨穿刺，會在采集時帶給供體痛苦。除此之外，骨髓來源的間充質(zhì)干細(xì)胞采集數(shù)量較少，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞會

2、隨著供體年齡的增大而不斷減少，且病毒感染率較高。但臍帶來源的間充質(zhì)干細(xì)胞與骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞相比具有很多優(yōu)勢，臍帶視為新生兒廢棄物，取材容易，對母體和供體均無傷害，且存在的干細(xì)胞數(shù)量多，活性高，并可以多次使用，更為重要的是，臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞具有非常低的免疫原性，臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子具有免疫調(diào)節(jié)的功能，并且可以提供造血支持，所以臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞無論是在細(xì)胞來源或是臨床應(yīng)用上都比骨髓來源的間充質(zhì)干細(xì)胞具有優(yōu)勢。但如何不斷優(yōu)化人臍帶間

3、充質(zhì)干細(xì)胞的分離和培養(yǎng)工藝，不但能明顯提高細(xì)胞數(shù)量、縮短細(xì)胞生長周期，還能節(jié)省原材料、時間和人力成本，已成為規(guī)模性企業(yè)不斷研究的目標(biāo)。
　　本實(shí)驗(yàn)的目的:1、通過不同的分離方法，優(yōu)化分離工藝，提高細(xì)胞數(shù)量。2、通過加入不同的生長因子，尋找出最適合的細(xì)胞體外培養(yǎng)條件。3、鑒定人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的生物學(xué)特性。4、鑒定人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的多向分化潛能。
　　本次實(shí)驗(yàn)研究方法:1、通過組織塊爬片分離法和酶消化法從新生兒的臍帶中分離出

4、人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞，將兩種分離方法得到的細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞數(shù)量、細(xì)胞傳代數(shù)和細(xì)胞傳代周期的統(tǒng)計學(xué)分析歸納比較，并對細(xì)胞進(jìn)行表面抗原鑒定。用流式細(xì)胞儀對貼壁細(xì)胞進(jìn)行鑒定是否高表達(dá)CD73、CD90和CD105，同時不表達(dá)CD45和CD34。2、取對數(shù)生長期的人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞，分別加入EGF、HGF和FGF三種生長因子進(jìn)行體外培養(yǎng)，在第3、6、9天分別觀察計數(shù)，測定不同生長因子在體外培養(yǎng)人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞時對促進(jìn)細(xì)胞增殖的作用。3、加入脂肪細(xì)胞

5、分化誘導(dǎo)培養(yǎng)基，進(jìn)行脂肪方向分化，鑒定人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的成脂分化潛能。4、加入成骨細(xì)胞分化誘導(dǎo)培養(yǎng)基，進(jìn)行成骨方向分化，鑒定人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的成骨分化潛能。
　　研究結(jié)論:1、通過實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，采用組織塊爬片分離法和酶消化法均能成功分離出臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞。但通過組織塊爬片分離法分離臍帶得到的效果無論在細(xì)胞數(shù)量還是細(xì)胞傳代數(shù)及細(xì)胞傳代周期上均優(yōu)于酶消化法。組織塊爬片分離法可以在相對較短的時間內(nèi)得到較多數(shù)量的臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞，同時

6、減少了細(xì)胞傳代數(shù)并縮短了細(xì)胞傳代周期。經(jīng)過酶消化法得到的細(xì)胞數(shù)量平均為1.53×107，組織塊爬片法分離得到的細(xì)胞數(shù)量平均為1.79×107。組織爬片分離法得到細(xì)胞不僅在數(shù)量上比酶消化法得到的細(xì)胞平均高出14.53％，而且所得到的細(xì)胞數(shù)據(jù)離散程度更小，數(shù)據(jù)更為穩(wěn)定，兩組數(shù)據(jù)呈顯著性差異(P＜0.05)，證明經(jīng)過組織爬片分離法分離培養(yǎng)得到的細(xì)胞在數(shù)量上優(yōu)于酶消化法，且經(jīng)過組織爬片分離法分離培養(yǎng)的細(xì)胞數(shù)量更為穩(wěn)定。酶消化法分離得到的平均細(xì)胞

7、培養(yǎng)天數(shù)為36.98天，平均傳代數(shù)3.09代，平均細(xì)胞傳代周期為12.23天/代;組織爬片分離法分離得到的平均細(xì)胞培養(yǎng)天數(shù)為23.60天，平均傳代數(shù)2.20代，平均細(xì)胞傳代周期為12.02天/代。組織爬片分離法得到的細(xì)胞平均培養(yǎng)天數(shù)比酶消化法得到的細(xì)胞平均培養(yǎng)天數(shù)減少了36.18％，兩組數(shù)據(jù)呈顯著性差異(P＜0.05)、平均傳代數(shù)減少了28.80％、平均細(xì)胞傳代周期縮短了1.72％。證明組織爬片分離法在細(xì)胞傳代周期上略優(yōu)于酶消化法，在縮

8、短細(xì)胞培養(yǎng)天數(shù)和傳代數(shù)方面均顯著優(yōu)于酶消化法。而且組織塊爬片分離法省去了酶消化的相關(guān)步驟，且因?yàn)榧?xì)胞數(shù)量增多而傳代次數(shù)的減少，從而節(jié)省了原材料成本、時間成本和人力成本。對于產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)運(yùn)作的企業(yè)來說，處理樣本的工藝目標(biāo)就是需要操作簡單、周期短、成本低。組織塊爬片分離法為企業(yè)的工藝優(yōu)化提供了可靠的理論基礎(chǔ)。2、經(jīng)流式細(xì)胞儀對組織爬片分離法和酶消化法分離得到的細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞表面鑒定，鑒定結(jié)果表明兩種分離方法得到的細(xì)胞均高表達(dá)CD73、CD90和

9、CD105，同時不表達(dá)CD45和CD34，均符合間充質(zhì)干細(xì)胞的生物學(xué)特性，屬于典型的間充質(zhì)干細(xì)胞，證明組織爬片分離法和酶消化法分離出的細(xì)胞為臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞。3、在體外培養(yǎng)人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞時，分別加入相同濃度20 ng/ml的EGF、HGF、FGF三種生長因子，第9天的細(xì)胞計數(shù)結(jié)果顯示，HGF和EGF對人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的促進(jìn)增殖作用明顯，EGF組的細(xì)胞增長率為135.3％，HGF組的細(xì)胞增長率為123.4％，但FGF組的細(xì)胞增長率僅

10、為10.93％。由此可見，HGF、EGF對人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞具有明顯的體外促進(jìn)細(xì)胞增殖的作用。而單獨(dú)使用FGF時，對人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞無明顯的體外促進(jìn)細(xì)胞增殖的作用。4、在獲得能穩(wěn)定傳代的臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞后，取第三代細(xì)胞對其進(jìn)行誘導(dǎo)分化，加入脂肪細(xì)胞分化誘導(dǎo)培養(yǎng)基，經(jīng)油紅O染色鑒定為脂肪細(xì)胞，證實(shí)了臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞可以朝著脂肪方向分化，確定了所分離培養(yǎng)的臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞具有多向分化的潛能，符合間充質(zhì)干細(xì)胞的生物學(xué)特性。5、在獲得能穩(wěn)定傳

11、代的臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞后，取第三代細(xì)胞對其進(jìn)行誘導(dǎo)分化，加入成骨細(xì)胞分化誘導(dǎo)培養(yǎng)基，經(jīng)茜紅素和Vonkossa's染色染鑒定為成骨細(xì)胞，證明了臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞朝著成骨方向誘導(dǎo)成功，確定了所分離培養(yǎng)的臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞具有多向分化的潛能，符合間充質(zhì)干細(xì)胞的生物學(xué)特性。
　　近十幾年來，國內(nèi)出現(xiàn)很多儲存新生兒臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞業(yè)務(wù)的生物公司，但如何能做到既節(jié)省人力、原材料和時間成本，又能做到減少污染、提高細(xì)胞數(shù)量、避免動物源蛋白和病原物的污