人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞促進(jìn)創(chuàng)面愈合及體外誘導(dǎo)分化為表皮樣細(xì)胞的實驗研究.pdf

1、目的：探討從新生兒臍帶華通氏膠中分離、培養(yǎng)人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞(umbilicalcord mesenchymal stem cells,UCMSCs),并對其表型鑒定以及生物學(xué)特性進(jìn)行檢測。將UCMSCs與兔異體皮+自體微粒皮復(fù)合移植于兔皮膚全層缺損創(chuàng)面,觀察UCMSCs促進(jìn)微粒皮修復(fù)創(chuàng)面的效果,為其臨床應(yīng)用提供實驗支持。觀察UCMSCs在不同孔徑的聚碳酸酯膜上生長和遷移情況,體外快速分離、培養(yǎng)表皮干細(xì)胞(epidermal stem

2、cells,ESCs),將UCMSCs與ESCs分別接種在聚碳酸酯膜正反兩面進(jìn)行共培養(yǎng),誘導(dǎo)UCMSCs分化為表皮樣細(xì)胞,為以UCMSCs做為組織工程皮膚種子細(xì)胞提供實驗依據(jù)。
　　 方法：⑴取正常足月產(chǎn)健康新生兒臍帶,采用酶消化法及組織塊法的方法分離培養(yǎng)UCMSCs。以相差顯微鏡、HE染色及透射電鏡觀察UCMSCs形態(tài)及超微結(jié)構(gòu)；以免疫熒光及流式細(xì)胞術(shù)鑒定細(xì)胞表面標(biāo)志物；通過MTT法檢測第1、3、5代細(xì)胞的增殖狀況,并繪制生長

3、曲線；流式細(xì)胞術(shù)檢測第2、4代細(xì)胞周期；通過成脂以及成骨實驗檢測人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞多向分化的潛能。⑵以腺病毒介導(dǎo)GFP基因體外轉(zhuǎn)染UCMSCs48h,于兔耳皮下注射移植,于3d、7d、14d、21d取材冰凍切片熒光顯微鏡下觀察GFP表達(dá)情況。取成年日本大耳兔8只,隨機(jī)抽取2只分為一組,同時構(gòu)建兔背部急性皮膚全層缺損創(chuàng)面模型(每只兔2個創(chuàng)面),交換移植同等大小面積的反削斷層皮,其真皮面均勻粘附兔自體微粒皮。所有兔頭側(cè)創(chuàng)面為UCMSCs移植

4、組(A組)、尾側(cè)為PBS空白自身對照組(B組)。于術(shù)后14d、21d觀察創(chuàng)面情況,計算21d創(chuàng)面愈合率,進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。于術(shù)后21d切取創(chuàng)面愈合區(qū)域組織,對標(biāo)本行HE染色觀察。⑶取健康包皮環(huán)切術(shù)患者包皮皮片,采用中性蛋白酶和胰酶消化結(jié)合Ⅳ型膠原黏附法分離、培養(yǎng)hESCs,以相差顯微鏡及HE染色觀察ESCs形態(tài)及生長特點(diǎn)；以免疫熒光染色鑒定細(xì)胞標(biāo)志CK19、P63和β1-integrin。⑷UCMSCs以絲裂霉素C處理后接種于常用的0.4

5、、3.0和8.0μm三種膜孔徑的6孔板Transwell插件中,培養(yǎng)7d,觀察、計數(shù)三種孔徑插件底部貼壁細(xì)胞,計算遷移率,并在掃描電鏡下觀察細(xì)胞在多孔膜上的生長、遷移情況。⑸在聚碳酸酯膜底面預(yù)培養(yǎng)ESCs的Transwell插件內(nèi)接種UCMSCs,使UCMSCs與ESCs在聚碳酸酯膜正反兩面生長形成非直接接觸式共培養(yǎng),誘導(dǎo)UCMSCs向表皮細(xì)胞分化。共培養(yǎng)10d后,消化收集細(xì)胞,爬片后進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察；并進(jìn)行免疫熒光染色檢測細(xì)胞標(biāo)志物CK

6、19、P63和β1-integrin的變化；收集誘導(dǎo)后細(xì)胞通過Western blotting及qRT-PCR的方法,在mRNA和蛋白水平檢測CK19、P63和β1-integrin表達(dá)情況；通過流式細(xì)胞術(shù)檢測Transwell新型共培養(yǎng)與傳統(tǒng)共培養(yǎng)誘導(dǎo)后細(xì)胞CK19表達(dá)率。
　　 結(jié)果：①采用復(fù)合酶消化法和組織塊法培養(yǎng)均從臍帶華通氏膠中分離出成纖維樣細(xì)胞,細(xì)胞呈梭形或多角形,呈旋渦狀生長。透射電鏡觀察,細(xì)胞核大且不規(guī)則,核仁明

7、顯,細(xì)胞漿較少,細(xì)胞器以粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和線粒體為主。MTT法繪制生長曲線顯示,各代細(xì)胞經(jīng)過1d的潛伏期后,進(jìn)入對數(shù)增殖期,第7d之后開始出現(xiàn)不同的接觸抑制。細(xì)胞周期檢測80％以上的細(xì)胞處于靜止期。流式細(xì)胞儀檢測顯示分離培養(yǎng)的細(xì)胞表達(dá)CD44(98.07％)、CD105(95.29％)、CD73(98.58％)、CD29(99.50％)和HLA-Ⅰ(99.80％),不表達(dá)CD34(0.59％)、CD31(0.24％)、CD45(1.91％)和

8、HLA-DR(1.18％)。免疫熒光染色顯示,細(xì)胞CD90和CD44陽性表達(dá),CD31和CD45陰性表達(dá)。在體外特殊誘導(dǎo)條件下,這些細(xì)胞能夠向脂肪細(xì)胞和成骨細(xì)胞分化,顯示它們具有多向分化潛能。②腺病毒介導(dǎo)的GFP基因轉(zhuǎn)染UCMSCs后48h,熒光顯微鏡觀察顯示轉(zhuǎn)染UCMSCs可有效表達(dá)GFP。于兔耳皮下注射移植后3d、7d時取材冰凍切片觀察,UCMSCs較強(qiáng)表達(dá)GFP；14d、21d取材觀察仍有GFP減弱表達(dá)。術(shù)后21d創(chuàng)面愈合率A組高

9、于B組(P<0.05)。愈合后創(chuàng)面取材病理學(xué)觀察可見表皮層下大量不規(guī)則膠原纖維,成纖維細(xì)胞以及小血管,缺少皮膚附件；移植組表皮層可發(fā)現(xiàn)表皮釘突樣結(jié)構(gòu),而對照組表皮層底部平坦,與基底結(jié)合較為疏松。③中性蛋白酶和胰酶消化結(jié)合Ⅳ型膠原黏附法分離、培養(yǎng)ESCs,形態(tài)學(xué)觀察可見hESCs呈扁圓狀多角形,融合后呈鋪路石樣生長；免疫熒光染色鑒定細(xì)胞標(biāo)志CK19、P63和β1-integrin均呈陽性表達(dá)。④培養(yǎng)7d后,0.4μm、3.0μm和8.0μ

10、m三種Transwell插件內(nèi)貼壁UCMSCs的遷移率分別為0、1.8％、8.0％,0.4μm孔徑聚碳酸酯膜膜細(xì)胞遷移率為0。掃描電鏡下觀察到細(xì)胞在3.0μm和8.0μm孔徑聚碳酸酯膜底面生長以及穿越微孔的現(xiàn)象,而在0.4μm孔徑膜則未發(fā)現(xiàn)。⑤UCMSCs與ESCs在聚碳酸酯膜正反兩面非直接接觸式共培養(yǎng)10d后,誘導(dǎo)組UCMSCs形態(tài)呈扁圓狀多角形,而對照組細(xì)胞形態(tài)未變化；免疫熒光染色、Western blotting檢測誘導(dǎo)組細(xì)胞CK

11、19、P63陽性表達(dá),對照組則為陰性；實時定量PCR檢測CK19、P63 mRNA表達(dá),誘導(dǎo)組表達(dá)水平顯著高于對照組,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。而β1—integrin的各種表達(dá)誘導(dǎo)組細(xì)胞與對照組相比沒有明顯減弱。流式細(xì)胞術(shù)檢測CK19陽性率,新型共培養(yǎng)誘導(dǎo)組(54.3％)與傳統(tǒng)Transwell共培養(yǎng)誘導(dǎo)組(11.4％)相比,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。
　　 結(jié)論：通過兩種方法能夠從臍帶分離、培養(yǎng)出MSCs