人臍帶間充質(zhì)干細胞向肝樣細胞分化的體外研究.pdf

1、目的：探討人臍帶間充質(zhì)干細胞分離、培養(yǎng)的方法，研究其基本生物學特性。初步探討人臍帶間充質(zhì)干細胞向肝樣細胞誘導分化的方法。 方法：無菌條件下收集剖宮產(chǎn)新生兒臍帶，利用PBS沖洗臍動脈及臍靜脈，將血液沖洗盡，將其剪碎至1mm3后，加入IV型膠原酶(0.1％)消化60min，然后加入胰酶(0.125％)消化30min，利用濾網(wǎng)過濾后收集細胞，DMEM(5％FBS)重懸細胞接種于培養(yǎng)瓶內(nèi)進行原代培養(yǎng)，待細胞生長至80-90％融合后進行1

2、:3傳代培養(yǎng)，取傳代培養(yǎng)細胞進行形態(tài)學觀察、免疫細胞化學染色、流式細胞儀檢測、生長活性、細胞周期分析、染色體數(shù)目分析及軟瓊脂克隆形成實驗。進一步取第6代細胞經(jīng)胰酶消化后接種于12孔板中，待細胞生長至約70％融合后，利用兩步誘導法進行誘導，對照組用原培養(yǎng)液培養(yǎng)。誘導組中加入0.5μM/L地塞米松，50g/LITS，20μg/LHGF，10μg/LFGF4，煙堿0.61g/L，共10天。后期加入20μg/LOSM，0.5μM/L地塞米松，5

3、0g/LITS。每3d換液1次，在不同誘導階段收集細胞后觀察細胞形態(tài)，免疫細胞化學，RT-PCR，糖原染色。 結(jié)果：利用膠原酶及胰酶兩步消化法能充分消化臍帶，細胞易于獲得，收集細胞后進行原代培養(yǎng)，24小時可觀察到貼壁細胞，待生長至10天時可見細胞長滿瓶底，進行傳代培養(yǎng)，每周傳代1次。觀察細胞形態(tài)為長梭形，不規(guī)則形，細胞大小不一，類似成纖維細胞，呈漩渦樣生長。取第6-9代細胞行免疫細胞化學染色結(jié)果顯示細胞強表達CD105、Vime

4、ntin，基本不表達CD34、CD31、CD133。經(jīng)流式細胞儀檢測表達CD29、CD49、CD105，基本不表達造血細胞標志CD34。MTT實驗顯示細胞倍增時間為22h。細胞周期分析表明75％-85％細胞處于G0/G1。染色體分析可見細胞染色體條數(shù)正常。在軟瓊脂中無克隆形成。經(jīng)誘導后的細胞在培養(yǎng)到第14d可見細胞形態(tài)出現(xiàn)變化，細胞長突起逐漸消失，逐漸轉(zhuǎn)為圓形或卵圓形，經(jīng)免疫組化檢測可見細胞在第1周開始表達AFP，第2周時CK18、CK

5、19、OV6的表達被觀察到。在誘導第3周時ALB表達被觀察到，AFP表達逐漸減弱。到第4周AFP的表達基本消失，ALB的表達增強。RT-PCR結(jié)果顯示細胞于第1周開始表達AFP，至誘導后期，AFP表達水平逐漸降低。于第3周時觀察到ALB表達，隨時間延長ALB表達逐漸增強。于第4周糖原染色呈陽性結(jié)果。 結(jié)論：經(jīng)酶消化法可從臍帶中獲得間充質(zhì)干細胞，易于獲得，體外增殖能力強，與骨髓來源間充質(zhì)干細胞的免疫表型相一致，符合間充質(zhì)干細胞基本